羅　妍，王　遷

(中國醫(yī)學科學院 北京協和醫(yī)學院 北京協和醫(yī)院風濕免疫科，風濕免疫病學教育部重點實驗室，北京 100730)

ChinJAllergyClinImmunol，2014，8(3)：248- 253

系統性硬化癥(systemic sclerosis，SSc)是一種以皮膚及多系統炎性纖維化、小血管病變?yōu)橹饕卣鞯淖陨砻庖呒膊?。其發(fā)病機制不清。目前認為，包括血管病變、炎性反應、纖維化及自身免疫4大機制相互作用。血管病變可能是始動因素，血管內皮細胞凋亡或功能紊亂，毛細血管舒縮功能、通透性改變，之后血栓形成、炎性反應激活，最終導致血管閉塞、組織缺血缺氧。炎性反應發(fā)生于疾病早期，皮膚病變以CD4+T細胞及單核細胞浸潤為主，而肺部病變處則以CD8+T細胞為主，二者可能發(fā)病機制不完全相同?；颊哐灏l(fā)現多種自身抗體，其中最具有標志性的是抗DNA拓撲異構酶Ⅰ抗體(抗Scl-70抗體)及抗著絲點抗體。處于核心地位的纖維化主要由血管病變和炎性反應起始，多種生長因子、趨化因子參與調控，轉化生長因子(transforming growth factor，TGF)β通路主要參與，最終促進纖維化過程[1]。

對SSc發(fā)病機制的了解有助于及早診斷和探索更有效的治療手段，因此能夠模擬疾病的動物模型起到不可或缺的作用。目前，已有多種模擬SSc的動物模型，但無一種能完美代表這種疾病，不同的研究目的需選擇不同的動物模型，本文將就目前常用的SSc動物模型的建模方法、模擬性及應用方面進行綜述，希望能為研究者選擇正確的、合適的動物模型提供幫助。

動物模型分類

SSc的動物模型從建模方法上可以分為兩大類，即誘導模型和基因模型。前者主要包括博來霉素誘導小鼠模型、慢性硬皮病樣移植物抗宿主病模型及活性氧簇活性氧離子(reactive oxygen species，ROS)介導模型；后者則又分為突變模型及轉基因模型，突變模型主要包括緊皮鼠(tight skin mouse，TSK)模型和UCD200206小雞模型，轉基因模型則包括Fra-2、TBRICA； Cre-ER、TβRIIΔk、Caveolin-1模型等。前文簡述了SSc的4大基本特點，故將主要從這些方面將模型與SSc患者進行比較(表1)。

表1　常見動物模型主要特點

誘導模型

博來霉素誘導小鼠模型：該是目前應用最廣泛的一種硬皮病動物模型，它可模擬硬皮病早期炎性反應階段[2]。早期常用博來霉素給小鼠氣管內灌注或吸入建立肺纖維化的動物模型[3]，后發(fā)現皮下注射數周后可出現注射局部皮膚纖維化、肺纖維化及血清抗體陽性等SSc表現[3-5]。不同品系小鼠敏感性不同，BALBc小鼠相對耐藥，而C3HHe、B10.A等更加敏感[5]。該模型小鼠纖維化部位可見膠原沉積、TGFβ1轉錄增加、肌成纖維細胞分化激活，并伴以巨噬細胞、T細胞及漿細胞為主的炎性細胞浸潤[6]，輔助性T細胞(helper T cell，Th)2反應相關因子白細胞介素(interleukin，IL)- 4、IL-13水平升高[5，7]。小鼠血清抗核抗體(anti-nuclear antibody，ANA)(+)，包括抗Scl-70抗體、抗CENP B抗體、抗U1RNP抗體、抗組蛋白抗體、抗雙鏈DNA抗體等[7]。該模型總體毛細血管含量增加不符合SSc患者特點，也未見硬皮病特征性的中小動脈閉塞性血管病[3]。其發(fā)病機制可能由活性氧簇ROS介導免疫炎性反應，最終激活成纖維細胞及TGFβ通路，引起纖維化[7](圖1)。

博來霉素誘導小鼠模型廣泛應用于SSc發(fā)病機制研究及新藥治療效果觀察。目前研究以基因層面、蛋白質水平、細胞水平較多，發(fā)病機制方面與免疫炎性反應有關的靶點包括T細胞、B細胞、炎性細胞與成纖維細胞間的相互作用以及相關細胞因子如IL-6[8]、IL-17[9]、IL-33[10]、TNF-α[11]等，纖維化通路靶點則從經典的TGFβSmad通路[7]、Wnt通路[12]中參與信號轉導的各種蛋白，到新發(fā)現的TGFβ非Smad通路[7]、黏附分子[13]以及某些激素等[14]。轉錄翻譯的調控層面例如表觀遺傳學、miRNA的研究相對較少。治療探索方面，與發(fā)病機制相關的有過氧化物酶體增生物激活受體[15]、酪氨酸激酶[16]、TGFβSmad通路，其他還有N-乙酰半胱氨酸[17]、雷帕霉素[18]、沙利度胺[19]等，甚至干細胞治療[20]、皮膚光照治療PUVA[21]等。但該模型炎性反應過重且非炎性反應的后期階段表現相對較弱，某些情況下尤其是治療學研究方面必須與非炎性模型聯合應用[2]。另外由于幾乎不能模擬血管病變，故在血管病變的研究受到限制。

慢性硬皮病樣移植物抗宿主病模型：慢性硬皮病樣移植物抗宿主病模型(chronic sclerodermatous GVHD model)，以下簡稱Scl-GVHD模型，也是一種以炎性表現為特點的動物模型。該模型的建立基于進行過異體造血干細胞移植的長期生存者中約40-60%會出現自身免疫病表現的慢性移植物抗宿主病[3]。1983年Jaffee等將B10.D2小鼠的脛骨、股骨骨髓及脾制成淋巴細胞懸液移植入接受亞致死劑量照射過的BALBc小鼠體內，3周左右受體小鼠出現全身多器官纖維化[22]。如將受體換成固有免疫缺陷的RAG-2小鼠可降低死亡率，其肺纖維化相對較輕而皮膚纖維化更嚴重[23]。標準Scl-GVHD模型在移植后3周左右出現肺、皮膚、肝、腎、胃腸道、腮腺等多器官纖維化，在纖維化出現之前1周病灶處有以單核細胞為主的炎性細胞浸潤，且這些細胞為供體來源[3]。小鼠血清ANA(+)但種類不明。其機制尚不明，目前認為小鼠血清及組織中趨化因子升高可能參與炎性反應及纖維化。Scl-GVHD因移植技術比較復雜而應用受到一定限制，且移植后動物處于免疫抑制易發(fā)生感染而死亡，故應用相對較少[3]。

圖1　博來霉素誘導模型機制Fig 1　Mechanism of bleomycin-induced model　　　ECM：細胞外基質

ROS介導的動物模型：既往研究發(fā)現，SSc患者的成纖維細胞可自發(fā)產生大量活性氧簇ROS，可促進膠原合成[7]，在此基礎上2009年建立了ROS介導的小鼠模型。給小鼠皮下注射過氧亞硝酸鹽(ONOO-)可引起注射部位限制性皮膚損害以及血清抗CENP B抗體陽性；如皮下注射次氯酸(OH·HOCl)持續(xù)6周則可引起小鼠皮下及肺纖維化、腎損害以及血清抗Scl-70抗體(+)。這兩種試劑注入體內后均可產生ROS。該模型病灶局部有T細胞為主的炎性細胞浸潤，早期可見到血管內皮細胞破壞[7，24]。該模型由于建立時間較短而應用不多。研究者利用該模型發(fā)現SSc皮膚及肺部纖維化發(fā)病機制不同的可能機理，皮膚原位為成纖維細胞內形成ROS直接激活Ras通路，而ROS可氧化的蛋白可入循環(huán)誘導自身抗體產生，并到遠隔臟器引起炎性及纖維化。在該模型中首次證實抗Scl-70抗體直接參與致病(圖2)。

基因突變模型

TSK模型：TSK模型包括TSK-1及TSK-2，其基因突變位點不同但表現相似。B10.D2(58N)Sn近交系小鼠2號染色體原纖維蛋白基因1(fibrillin gene 1，Fbn-1)發(fā)生顯性突變，純合體在胚胎階段死亡，雜合體就是TSK-1小鼠模型，該基因可編碼細胞外基質的結構蛋白原纖維蛋白，故該模型的最顯著特點是纖維化[25]。TSK-1小鼠具有皮膚和肺纖維化，但其病理特點與SSc患者并不完全相符合：小鼠皮膚纖維化發(fā)生于皮下、較深，筋膜層、肌層等受累，而SSc患者皮膚纖維化部位多位于真皮內；小鼠肺部受累以肺氣腫為主要表現，在SSc患者中無此特點[26]。TSK-1小鼠皮膚病灶處無炎性細胞浸潤的證據，故為非炎性模型的代表。未見小鼠發(fā)生內皮凋亡、小動脈閉塞等其他血管病變。該模型血清ANA升高，鑒定出的類型有抗Scl-70抗體、抗雙鏈DNA抗體、抗RNA聚合酶Ⅰ抗體等[3]。TSK-1模型常與博來霉素誘導模型聯合應用，后者主要模擬早期炎性階段，而該模型主要用于模擬纖維化階段。就目前已發(fā)表的研究來看，該模型的獨特之處在于發(fā)現明確的B細胞活化，故較多應用于B細胞如何參與發(fā)病機制以及以B細胞為目標的治療探索。但該模型纖維化病變與系統性硬化患者不完全相符合，應用受到一定限制。TSK-2小鼠為101H小鼠由致突變劑乙基亞硝基誘變后的子代，亦為常染色體顯性突變，尚未確定責任基因。該模型與TSK-1相比具有以單核細胞浸潤為主的炎性反應，其余表現類似，比TSK-1在模擬性方面更加全面[27]。目前因機制不清，應用較少。

轉基因模型

轉基因模型由于依賴較為復雜的轉基因技術，并且靶點單一、無法模擬疾病全貌，故應用相對不是特別廣泛，在這里對一些模型做簡要介紹。

Fra-2是轉錄因子激活蛋白(activator protein-1， AP-1)家族成員，參與應激反應、細胞增殖、凋亡、炎性反應、損傷修復、癌變等許多生命基本過程。2008年偶然在由H2KB啟動子介導的Fra-2過表達小鼠中觀察到肺纖維化[30]，后又發(fā)現其具有微血管內皮凋亡、皮膚毛細血管減少、肺動脈高壓等血管病變[31]。肺動脈高壓會使小鼠壽命極大降低，影響其應用。由于目前只有極少數模型能夠模擬系統性硬化的血管病變，尤其是SSc相關肺動脈高壓，故在未來的研究中具有一定的意義[2-3]。

TGFβ通路是纖維化中一條非常重要的通路，因此通過持續(xù)激活該通路可能創(chuàng)造新的纖維化模型。如TBRICA； Cre-ER轉基因小鼠是在TGFβRI基因的上游引入增強子和他莫昔芬誘導Crelox P系統，小鼠出生后通過注射他莫昔芬來持續(xù)性激活成纖維細胞內TGFβRI表達[32]。小鼠出現皮膚纖維化，不會自發(fā)出現肺纖維化，但對博來霉素比普通小鼠更加敏感。病灶無明顯炎性浸潤，無典型血管病變，血清未見自身抗體。另一種TβRIIΔk轉基因小鼠的目標基因是一種激酶有缺陷的突變TGFβRII，突變后該受體可結合胞外游離的TGFβ，但隨后不能磷酸化TGFβRI并進一步起始信號轉導，使得體內TGFβ代償性上調，TGFβ通路被激活[33]。這種小鼠在生后6周出現肺纖維化，12周時約25%的小鼠出現皮膚纖維化，另外部分還可出現纖維性心肌病[3]。這些模型也主要應用于TGFβ通路介導的纖維化的研究。

Caveolin-1是一種特異性脂筏，可介導TGFβ受體內化而使下調TGFβ通路，該蛋白敲除的小鼠以纖維化病變和血管病變?yōu)橹鱗34]。小鼠可出現肺部和皮膚纖維化，其肺部臨床類似于放射性肺炎，病理表現為肺泡間隔細胞外基質蛋白沉積。小鼠微血管病變表現為血管因內皮細胞功能紊亂引起張力異常、通透性增加，大小動脈均可受累，并可出現肺動脈高壓。該模型機制比較復雜，因為Caveolin-1作為脂筏可引起除TGFβR之外的其他受體內化而影響其他多個通路。但模型本身卻為SSc的治療提供一種思路，即通過外源引入Caveolin-1來促進TGFβ通路下調從而抑制纖維化[35]。

總　　結

SSc的動物模型中，能夠模擬早期炎性階段的主要模型為博來霉素誘導模型、慢性硬皮病樣GVHD模型，以纖維化為主要特點的模型有TSK模型、各種以TGFβ通路為靶點的轉基因模型等，而進行微血管病變的相關研究則主要利用突變模型UCD200小雞以及轉基因模型Fra-2小鼠。在這些所有模型中，沒有一種能夠完美模擬人類的SSc，所以在選擇合適的動物模型前應當明確自己的研究目的，廣泛了解各種模型的特點，以便于選擇最合適的研究模型，獲得最有意義的結果。

(本文圖2見封三)

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