姜穎，潘慶杰

青島農(nóng)業(yè)大學 動物生殖發(fā)育與基因工程研究所，山東 青島 266109

在精子發(fā)生過程中，精原干細胞（spermatogoni?al stem cells，SSC）是關(guān)鍵的中間環(huán)節(jié)之一。精原干細胞一方面能夠進行自我更新來維持體內(nèi)雄性配子庫數(shù)目的相對恒定；另一方面能夠定向分化，在分化的過程中產(chǎn)生不同類型的精原細胞，最后形成精子。精原干細胞又是動物體內(nèi)惟一能將遺傳信息傳遞給下一代的具有可塑性的成體干細胞類型。由于放化療對生殖細胞的影響及某些雄性動物先天的生殖缺陷，將體外培養(yǎng)的精原干細胞進行移植可恢復(fù)不育雄性動物的生育能力。此外，對體外培養(yǎng)的精原干細胞進行轉(zhuǎn)基因，可以獲得優(yōu)良品種的后代或用于保存物種資源。

1 生物學特性

精原干細胞來源于原始生殖細胞（primordial germ cells，PGC）。原始生殖細胞在胚胎發(fā)育早期產(chǎn)生、遷移和定位后，在周圍環(huán)境的誘發(fā)下分化為性原細胞（gonocytes），隨著生精小管管腔形成，性原細胞逐漸遷移至曲精細管基底層，出生后的性原細胞已達到一定數(shù)量且轉(zhuǎn)變?yōu)榫杉毎?，直至青春期，SSC開始進行精子發(fā)生循環(huán)。Dym[1]和Clermont等[2]通過蘇木精對細胞核著色的不同，將靈長類睪丸中未分化的精原細胞分為2種類型，一種是Ad型精原細胞（dark type A spermatogonia），也被形象地描述為儲備干細胞，在青春期后有絲分裂保持靜止狀態(tài)；另一種是Ap型精原細胞（pale type A spermatogo?nia），也被形象地描述為自我更新干細胞，有絲分裂保持活躍狀態(tài)。Hermann等認為嚙齒類動物未分化的精原干細胞包含 As到 Aal（16）之間的細胞類型[3]。目前只有As型（type A-single）細胞能夠進行自我更新或分裂產(chǎn)生通過間橋相連的2個細胞，被稱為Apr型（type A-paired）細胞；Apr型細胞進一步有絲分裂產(chǎn)生間橋連接的4、8、16個細胞的Aal型（type A-aligned）細胞。Apr和Aal為精原干細胞分化的中間過度類型，Aal通過不斷的有絲分裂，分別形成A1、A2、A3、A4、In（中間型）和B型精原細胞，之后經(jīng)2次減數(shù)分裂分別形成初級精母細胞和次級精母細胞，再分化為精子細胞，最終形成精子[4]。

2 分離與培養(yǎng)

2.1 分離的時間選取與純化方法

在動物體內(nèi)精原干細胞的數(shù)量極少，僅占生精細胞總數(shù)的0.02%～0.03%[5]。為了深入研究SSC，分離不同動物SSC的時間選取尤為重要。分離過早，SSC還未完全形成；分離過晚，隨著動物睪丸的成熟，SSC開始分化為不同類型的精原細胞，純化后雜質(zhì)細胞較多。因此，一般選取出生后不久或青春期前的動物來分離和培養(yǎng)精原干細胞。小鼠選用出生后6～8 d，大鼠選用9～10 d，兔選用1個月以內(nèi)，雞選用15～19 d雞胚[6]，牛的最適期為5～7月齡[7]，羊為4月齡[8]，豬為1月齡[9]。

由于睪丸中存在多種類型的細胞，所以分離后的SSC要進行純化。目前應(yīng)用的純化方法主要有盤化法、差速貼壁法、Percoll不連續(xù)密度梯度離心法、免疫磁珠分選法和流式細胞儀分選法。張秀娟等[10]比較了差速貼壁法和Percoll不連續(xù)密度法對SSC的純化效果，發(fā)現(xiàn)Percoll不連續(xù)密度梯度法純化后的細胞與純化前的細胞總量無論在回收細胞比率還是AP陽性率上都低于差速貼壁法。免疫磁珠分選法和流式細胞儀分選法都是利用細胞表面表型來純化細胞。免疫磁珠分選法是使細胞表面的特異表面抗原結(jié)合抗體，然后與磁珠偶聯(lián)篩選出陽性細胞，最后收集陽性細胞；流式細胞儀分選是使細胞表面標記結(jié)合熒光素標記抗體，再經(jīng)流式細胞儀分選。但由于流式細胞儀對細胞損傷較大而多選用免疫磁珠分選法，流式細胞儀分選法多用于檢測細胞類型。

2.2 體外培養(yǎng)

適當?shù)呐囵B(yǎng)條件可使純化的SSC提高增殖效率、維持干細胞狀態(tài)、延長存活時間。所以要盡量在體外創(chuàng)造動物體內(nèi)的微環(huán)境，其中飼養(yǎng)層的選取是創(chuàng)造良好微環(huán)境的第一步。小鼠胚胎成纖維細胞飼養(yǎng)層（mouse embryonic fibroblast，MEF）是最基本的一種飼養(yǎng)層，目前常用的培養(yǎng)精原干細胞的飼養(yǎng)層還有睪丸支持細胞飼養(yǎng)層和STO細胞飼養(yǎng)層等。培養(yǎng)基和血清的選取在不同的實驗中均有報道，但目前還沒有固定的配制方案，可根據(jù)實驗物種及實驗條件選取最適配方。在體外培養(yǎng)SSC時必須添加的是細胞因子，其中膠質(zhì)細胞源性神經(jīng)營養(yǎng)因子（gli?al cell line-derived neurotrophic factor，GDNF）是支持細胞分泌的能促進精原干細胞增殖的一種細胞因子。實驗發(fā)現(xiàn)，不添加鼠白血病抑制因子（mouse leukemia inhibitory factor，LIF）組的SSC活細胞數(shù)量比單因子添加組顯著減少，組合添加LIF、GDNF和堿性成纖維細胞生長因子（basic fibroblast growth factor，bFGF）可促進 SSC的增殖[10]。孫大林[11]指出，在干細胞存活、分裂增殖及克隆形成等方面，bFGF、干細胞因子（stem cell factor,SCF）和可溶性的GFR-α1（GDNF的受體）等起到促進作用。陳曉宇等[12]分離SSC后進一步純化，比較了差速貼壁法和盤化法，發(fā)現(xiàn)盤化法處理后的SSC在形態(tài)上比差速貼壁法處理的SSC更均一，而且形成集落的AKP陽性率也明顯高于差速貼壁法，但SSC經(jīng)差速貼壁法處理后在集落形成時間和集落數(shù)方面都優(yōu)于盤化法，認為造成這一現(xiàn)象的原因可能是差速貼壁法在純化細胞過程中摻入了一些體細胞，導(dǎo)致集落在生長速度和出現(xiàn)時間方面表現(xiàn)出大幅的跳躍。

微滴培養(yǎng)法是一種新興的培養(yǎng)方法，Brinster首次將微滴培養(yǎng)法用于卵子和胚胎的培養(yǎng)，指出微滴培養(yǎng)在觀察卵子和胚胎及收集數(shù)據(jù)資料方面有顯著效果[13]。Yasuyuki[14]將微滴培養(yǎng)法用于培養(yǎng)SSC，發(fā)現(xiàn)石蠟油可以保護細胞免受污染，減少蒸發(fā)，并且能夠保持溫度和pH值的穩(wěn)定。有研究指出，通過覆蓋液體油滴，不僅可維持正常的培養(yǎng)液滲透壓，而且可以保證培養(yǎng)液內(nèi)細胞對營養(yǎng)的需要，從而為細胞提供一個理想的生長環(huán)境[15]。

3 鑒定

體外培養(yǎng)的SSC貼壁速度慢，支持細胞貼壁速度較快且逐漸呈不規(guī)則形狀生長平鋪培養(yǎng)皿。精原干細胞呈圓形或橢圓形，細胞核大，胞漿少且折光性強，常染色質(zhì)多而異染色質(zhì)少。培養(yǎng)初期精原干細胞呈單個細胞或幾個成團存在，隨著培養(yǎng)時間的增加，以鏈狀或葡萄串狀的集落形態(tài)存在。

AKP染色常用來檢測細胞的干性，因為未分化的多能干細胞膜上有高水平的堿性磷酸酶表達[16]。精原干細胞也是干細胞，具有分化潛能，所以AKP常作為鑒定SSC的方法之一。

用免疫細胞化學技術(shù)檢測SSC表面的不同標志物是鑒定SSC的另一重要手段。常用的SSC細胞表面標志物有β1整合素、α6整合素、Thy-1、Oct4、Stra8、GFRα-1和c-kit。Shinohara等[17]利用β1或α6整合素抗體篩選小鼠睪丸體細胞，在受體睪丸中可見克隆顯著增加且有供體來源的精子發(fā)生，隨后運用生物功能檢測系統(tǒng)證明β1和α6整合素是與精原干細胞相關(guān)的抗原。Thy-1（CD90）是免疫球蛋白超家族中的一種糖蛋白，它在包括小鼠精原干細胞在內(nèi)的許多干細胞中表達[18]。Oct-4是首個發(fā)現(xiàn)的只在多能干細胞中表達的轉(zhuǎn)錄因子，為核特異表達，因此不僅成為檢測干細胞的標志物之一，而且成為控制胚胎干細胞多能性的主要因子[19]。研究發(fā)現(xiàn)，在未分化的組織中Oct-4有較強的表達[20]。Stra8是生殖細胞特異的標志物之一，Oulad-Abdelghani等[21]證實在減數(shù)分裂前有Stra8的表達。Koubova等[22]發(fā)現(xiàn)睪丸組織Stra8的表達可通過視黃酸（RA）得到激活。Naugh?ton等[23]研究表明，GFRα-1受體存在于生殖細胞，在新生小鼠的性原細胞中表達，但在正常精子發(fā)生過程中受到抑制，其對小鼠SSC自我更新有重要作用。c-kit是SCF的受體，SCF由支持細胞分泌，c-kit存在于細胞膜上且在減數(shù)分裂后不表達。Ohta等[24]發(fā)現(xiàn)c-kit在用于分化的A型精原干細胞中表達，在不用于分化的A型精原干細胞中不表達，推測c-kit在用于分化的A型精原干細胞到B型精原細胞間表達。其他表面標志物還有SSEA-1[25]、c-Ret[26]、CD9[27]、CD24、CD34、Ngn3[28]、EpCam[29]和PGP9.5[30]等。

在對SSC的研究中，尋找SSC特異表面標記的腳步從未停歇，通過表面標志物的結(jié)合可提高鑒定SSC的正確性。

4 移植及精原干細胞介導(dǎo)的轉(zhuǎn)基因

隨著研究的不斷深入，SSC體外培養(yǎng)時間不斷延長，但由于SSC還沒有特異的分子標志物，所以準確鑒定SSC的標準就是將SSC移植到不能產(chǎn)生雄性配子的雄性動物的曲精細管內(nèi)，一段時間后檢測受體睪丸內(nèi)是否有雄性配子產(chǎn)生。目前，使可育的雄性動物失去產(chǎn)生雄性配子功能的方法主要有白消安處理和射線處理。1994年，Brinster等[31]首次將供體小鼠睪丸中的精原干細胞移植到因用白消安處理而無雄性配子產(chǎn)生的同種小鼠睪丸中，結(jié)果發(fā)現(xiàn)受體能進行精子發(fā)生過程，這一移植實驗的成功為后續(xù)SSC介導(dǎo)的轉(zhuǎn)基因技術(shù)的發(fā)展奠定了基礎(chǔ)。

SSC介導(dǎo)的轉(zhuǎn)基因技術(shù)分為SSC體內(nèi)介導(dǎo)轉(zhuǎn)基因技術(shù)和體外介導(dǎo)轉(zhuǎn)基因技術(shù)。SSC體內(nèi)介導(dǎo)轉(zhuǎn)基因技術(shù)即利用表達載體攜帶外源基因，借助于表達載體的特殊作用和基因?qū)敕椒ǎ雇庠椿蜻M入SSC并整合到基因組中，以產(chǎn)生攜帶有外源基因的精子，最終制備轉(zhuǎn)基因動物[32]。在研究中雖然有轉(zhuǎn)基因的后代產(chǎn)生，但Virginie等[33]認為睪丸中包含精原干細胞到精子不同階段的存在形式，外源基因在整合時不一定發(fā)生在精子形成的什么階段，且SSC體內(nèi)介導(dǎo)轉(zhuǎn)基因技術(shù)效率很低，產(chǎn)生正常精子的效率更低。與SSC體內(nèi)介導(dǎo)轉(zhuǎn)基因技術(shù)相比，SSC體外介導(dǎo)轉(zhuǎn)基因技術(shù)的應(yīng)用效率更高。利用體外培養(yǎng)的SSC進行轉(zhuǎn)基因來獲得所需后代，主要有以下幾種方法：一種是將攜帶目的基因的SSC通過體外誘導(dǎo)分化為精子，然后與卵子體外受精后移植到受體動物體內(nèi)產(chǎn)生表達目的基因的后代；另一種是將轉(zhuǎn)基因的SSC移植到同種不可育或免疫缺陷雄性動物睪丸內(nèi)產(chǎn)生表達目的基因的精子，再通過自然交配或體外受精產(chǎn)生后代。有研究指出，有些動物通過異種移植精原干細胞也可以產(chǎn)生供體精子，但是受體動物都是未成熟且內(nèi)源性精子發(fā)生已破壞的免疫缺陷動物[32]。據(jù)此，是否可以利用未成熟、不育且免疫缺陷的異種動物睪丸來為SSC提供體內(nèi)精子發(fā)生的良好微環(huán)境，而后收集精液體外受精來得到所需后代，是一個有待研究的問題。由于SSC的體外培養(yǎng)體系還不夠完善，使SSC能長期培養(yǎng)、傳代而不分化還處于探索階段，技術(shù)水平也比較滯后，還須進一步深入研究。

5 結(jié)語

目前，小動物精原干細胞的研究進展比較顯著，精原干細胞可在體外培養(yǎng)較長時間，并且能進行基因操作和移植。由于精原干細胞目前還沒有特異性標志物，在動物體內(nèi)含量極少，且受限于技術(shù)條件，大型動物精原干細胞的研究還比較緩慢，探索道路也比較漫長。但精原干細胞的應(yīng)用潛能是不可忽視的，其研究在醫(yī)學、干細胞生物學、分子細胞生物學和發(fā)育生物學等領(lǐng)域都具有重要的應(yīng)用前景。

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