姜穎，潘慶杰

青島農(nóng)業(yè)大學(xué) 動物生殖發(fā)育與基因工程研究所，山東 青島 266109

在精子發(fā)生過程中，精原干細(xì)胞（spermatogoni?al stem cells，SSC）是關(guān)鍵的中間環(huán)節(jié)之一。精原干細(xì)胞一方面能夠進(jìn)行自我更新來維持體內(nèi)雄性配子庫數(shù)目的相對恒定；另一方面能夠定向分化，在分化的過程中產(chǎn)生不同類型的精原細(xì)胞，最后形成精子。精原干細(xì)胞又是動物體內(nèi)惟一能將遺傳信息傳遞給下一代的具有可塑性的成體干細(xì)胞類型。由于放化療對生殖細(xì)胞的影響及某些雄性動物先天的生殖缺陷，將體外培養(yǎng)的精原干細(xì)胞進(jìn)行移植可恢復(fù)不育雄性動物的生育能力。此外，對體外培養(yǎng)的精原干細(xì)胞進(jìn)行轉(zhuǎn)基因，可以獲得優(yōu)良品種的后代或用于保存物種資源。

1 生物學(xué)特性

精原干細(xì)胞來源于原始生殖細(xì)胞（primordial germ cells，PGC）。原始生殖細(xì)胞在胚胎發(fā)育早期產(chǎn)生、遷移和定位后，在周圍環(huán)境的誘發(fā)下分化為性原細(xì)胞（gonocytes），隨著生精小管管腔形成，性原細(xì)胞逐漸遷移至曲精細(xì)管基底層，出生后的性原細(xì)胞已達(dá)到一定數(shù)量且轉(zhuǎn)變?yōu)榫杉?xì)胞，直至青春期，SSC開始進(jìn)行精子發(fā)生循環(huán)。Dym[1]和Clermont等[2]通過蘇木精對細(xì)胞核著色的不同，將靈長類睪丸中未分化的精原細(xì)胞分為2種類型，一種是Ad型精原細(xì)胞（dark type A spermatogonia），也被形象地描述為儲備干細(xì)胞，在青春期后有絲分裂保持靜止?fàn)顟B(tài)；另一種是Ap型精原細(xì)胞（pale type A spermatogo?nia），也被形象地描述為自我更新干細(xì)胞，有絲分裂保持活躍狀態(tài)。Hermann等認(rèn)為嚙齒類動物未分化的精原干細(xì)胞包含 As到 Aal（16）之間的細(xì)胞類型[3]。目前只有As型（type A-single）細(xì)胞能夠進(jìn)行自我更新或分裂產(chǎn)生通過間橋相連的2個細(xì)胞，被稱為Apr型（type A-paired）細(xì)胞；Apr型細(xì)胞進(jìn)一步有絲分裂產(chǎn)生間橋連接的4、8、16個細(xì)胞的Aal型（type A-aligned）細(xì)胞。Apr和Aal為精原干細(xì)胞分化的中間過度類型，Aal通過不斷的有絲分裂，分別形成A1、A2、A3、A4、In（中間型）和B型精原細(xì)胞，之后經(jīng)2次減數(shù)分裂分別形成初級精母細(xì)胞和次級精母細(xì)胞，再分化為精子細(xì)胞，最終形成精子[4]。

2 分離與培養(yǎng)

2.1 分離的時間選取與純化方法

在動物體內(nèi)精原干細(xì)胞的數(shù)量極少，僅占生精細(xì)胞總數(shù)的0.02%～0.03%[5]。為了深入研究SSC，分離不同動物SSC的時間選取尤為重要。分離過早，SSC還未完全形成；分離過晚，隨著動物睪丸的成熟，SSC開始分化為不同類型的精原細(xì)胞，純化后雜質(zhì)細(xì)胞較多。因此，一般選取出生后不久或青春期前的動物來分離和培養(yǎng)精原干細(xì)胞。小鼠選用出生后6～8 d，大鼠選用9～10 d，兔選用1個月以內(nèi)，雞選用15～19 d雞胚[6]，牛的最適期為5～7月齡[7]，羊為4月齡[8]，豬為1月齡[9]。

由于睪丸中存在多種類型的細(xì)胞，所以分離后的SSC要進(jìn)行純化。目前應(yīng)用的純化方法主要有盤化法、差速貼壁法、Percoll不連續(xù)密度梯度離心法、免疫磁珠分選法和流式細(xì)胞儀分選法。張秀娟等[10]比較了差速貼壁法和Percoll不連續(xù)密度法對SSC的純化效果，發(fā)現(xiàn)Percoll不連續(xù)密度梯度法純化后的細(xì)胞與純化前的細(xì)胞總量無論在回收細(xì)胞比率還是AP陽性率上都低于差速貼壁法。免疫磁珠分選法和流式細(xì)胞儀分選法都是利用細(xì)胞表面表型來純化細(xì)胞。免疫磁珠分選法是使細(xì)胞表面的特異表面抗原結(jié)合抗體，然后與磁珠偶聯(lián)篩選出陽性細(xì)胞，最后收集陽性細(xì)胞；流式細(xì)胞儀分選是使細(xì)胞表面標(biāo)記結(jié)合熒光素標(biāo)記抗體，再經(jīng)流式細(xì)胞儀分選。但由于流式細(xì)胞儀對細(xì)胞損傷較大而多選用免疫磁珠分選法，流式細(xì)胞儀分選法多用于檢測細(xì)胞類型。

2.2 體外培養(yǎng)

適當(dāng)?shù)呐囵B(yǎng)條件可使純化的SSC提高增殖效率、維持干細(xì)胞狀態(tài)、延長存活時間。所以要盡量在體外創(chuàng)造動物體內(nèi)的微環(huán)境，其中飼養(yǎng)層的選取是創(chuàng)造良好微環(huán)境的第一步。小鼠胚胎成纖維細(xì)胞飼養(yǎng)層（mouse embryonic fibroblast，MEF）是最基本的一種飼養(yǎng)層，目前常用的培養(yǎng)精原干細(xì)胞的飼養(yǎng)層還有睪丸支持細(xì)胞飼養(yǎng)層和STO細(xì)胞飼養(yǎng)層等。培養(yǎng)基和血清的選取在不同的實驗中均有報道，但目前還沒有固定的配制方案，可根據(jù)實驗物種及實驗條件選取最適配方。在體外培養(yǎng)SSC時必須添加的是細(xì)胞因子，其中膠質(zhì)細(xì)胞源性神經(jīng)營養(yǎng)因子（gli?al cell line-derived neurotrophic factor，GDNF）是支持細(xì)胞分泌的能促進(jìn)精原干細(xì)胞增殖的一種細(xì)胞因子。實驗發(fā)現(xiàn)，不添加鼠白血病抑制因子（mouse leukemia inhibitory factor，LIF）組的SSC活細(xì)胞數(shù)量比單因子添加組顯著減少，組合添加LIF、GDNF和堿性成纖維細(xì)胞生長因子（basic fibroblast growth factor，bFGF）可促進(jìn) SSC的增殖[10]。孫大林[11]指出，在干細(xì)胞存活、分裂增殖及克隆形成等方面，bFGF、干細(xì)胞因子（stem cell factor,SCF）和可溶性的GFR-α1（GDNF的受體）等起到促進(jìn)作用。陳曉宇等[12]分離SSC后進(jìn)一步純化，比較了差速貼壁法和盤化法，發(fā)現(xiàn)盤化法處理后的SSC在形態(tài)上比差速貼壁法處理的SSC更均一，而且形成集落的AKP陽性率也明顯高于差速貼壁法，但SSC經(jīng)差速貼壁法處理后在集落形成時間和集落數(shù)方面都優(yōu)于盤化法，認(rèn)為造成這一現(xiàn)象的原因可能是差速貼壁法在純化細(xì)胞過程中摻入了一些體細(xì)胞，導(dǎo)致集落在生長速度和出現(xiàn)時間方面表現(xiàn)出大幅的跳躍。

微滴培養(yǎng)法是一種新興的培養(yǎng)方法，Brinster首次將微滴培養(yǎng)法用于卵子和胚胎的培養(yǎng)，指出微滴培養(yǎng)在觀察卵子和胚胎及收集數(shù)據(jù)資料方面有顯著效果[13]。Yasuyuki[14]將微滴培養(yǎng)法用于培養(yǎng)SSC，發(fā)現(xiàn)石蠟油可以保護(hù)細(xì)胞免受污染，減少蒸發(fā)，并且能夠保持溫度和pH值的穩(wěn)定。有研究指出，通過覆蓋液體油滴，不僅可維持正常的培養(yǎng)液滲透壓，而且可以保證培養(yǎng)液內(nèi)細(xì)胞對營養(yǎng)的需要，從而為細(xì)胞提供一個理想的生長環(huán)境[15]。

3 鑒定

體外培養(yǎng)的SSC貼壁速度慢，支持細(xì)胞貼壁速度較快且逐漸呈不規(guī)則形狀生長平鋪培養(yǎng)皿。精原干細(xì)胞呈圓形或橢圓形，細(xì)胞核大，胞漿少且折光性強(qiáng)，常染色質(zhì)多而異染色質(zhì)少。培養(yǎng)初期精原干細(xì)胞呈單個細(xì)胞或幾個成團(tuán)存在，隨著培養(yǎng)時間的增加，以鏈狀或葡萄串狀的集落形態(tài)存在。

AKP染色常用來檢測細(xì)胞的干性，因為未分化的多能干細(xì)胞膜上有高水平的堿性磷酸酶表達(dá)[16]。精原干細(xì)胞也是干細(xì)胞，具有分化潛能，所以AKP常作為鑒定SSC的方法之一。

用免疫細(xì)胞化學(xué)技術(shù)檢測SSC表面的不同標(biāo)志物是鑒定SSC的另一重要手段。常用的SSC細(xì)胞表面標(biāo)志物有β1整合素、α6整合素、Thy-1、Oct4、Stra8、GFRα-1和c-kit。Shinohara等[17]利用β1或α6整合素抗體篩選小鼠睪丸體細(xì)胞，在受體睪丸中可見克隆顯著增加且有供體來源的精子發(fā)生，隨后運用生物功能檢測系統(tǒng)證明β1和α6整合素是與精原干細(xì)胞相關(guān)的抗原。Thy-1（CD90）是免疫球蛋白超家族中的一種糖蛋白，它在包括小鼠精原干細(xì)胞在內(nèi)的許多干細(xì)胞中表達(dá)[18]。Oct-4是首個發(fā)現(xiàn)的只在多能干細(xì)胞中表達(dá)的轉(zhuǎn)錄因子，為核特異表達(dá)，因此不僅成為檢測干細(xì)胞的標(biāo)志物之一，而且成為控制胚胎干細(xì)胞多能性的主要因子[19]。研究發(fā)現(xiàn)，在未分化的組織中Oct-4有較強(qiáng)的表達(dá)[20]。Stra8是生殖細(xì)胞特異的標(biāo)志物之一，Oulad-Abdelghani等[21]證實在減數(shù)分裂前有Stra8的表達(dá)。Koubova等[22]發(fā)現(xiàn)睪丸組織Stra8的表達(dá)可通過視黃酸（RA）得到激活。Naugh?ton等[23]研究表明，GFRα-1受體存在于生殖細(xì)胞，在新生小鼠的性原細(xì)胞中表達(dá)，但在正常精子發(fā)生過程中受到抑制，其對小鼠SSC自我更新有重要作用。c-kit是SCF的受體，SCF由支持細(xì)胞分泌，c-kit存在于細(xì)胞膜上且在減數(shù)分裂后不表達(dá)。Ohta等[24]發(fā)現(xiàn)c-kit在用于分化的A型精原干細(xì)胞中表達(dá)，在不用于分化的A型精原干細(xì)胞中不表達(dá)，推測c-kit在用于分化的A型精原干細(xì)胞到B型精原細(xì)胞間表達(dá)。其他表面標(biāo)志物還有SSEA-1[25]、c-Ret[26]、CD9[27]、CD24、CD34、Ngn3[28]、EpCam[29]和PGP9.5[30]等。

在對SSC的研究中，尋找SSC特異表面標(biāo)記的腳步從未停歇，通過表面標(biāo)志物的結(jié)合可提高鑒定SSC的正確性。

4 移植及精原干細(xì)胞介導(dǎo)的轉(zhuǎn)基因

隨著研究的不斷深入，SSC體外培養(yǎng)時間不斷延長，但由于SSC還沒有特異的分子標(biāo)志物，所以準(zhǔn)確鑒定SSC的標(biāo)準(zhǔn)就是將SSC移植到不能產(chǎn)生雄性配子的雄性動物的曲精細(xì)管內(nèi)，一段時間后檢測受體睪丸內(nèi)是否有雄性配子產(chǎn)生。目前，使可育的雄性動物失去產(chǎn)生雄性配子功能的方法主要有白消安處理和射線處理。1994年，Brinster等[31]首次將供體小鼠睪丸中的精原干細(xì)胞移植到因用白消安處理而無雄性配子產(chǎn)生的同種小鼠睪丸中，結(jié)果發(fā)現(xiàn)受體能進(jìn)行精子發(fā)生過程，這一移植實驗的成功為后續(xù)SSC介導(dǎo)的轉(zhuǎn)基因技術(shù)的發(fā)展奠定了基礎(chǔ)。

SSC介導(dǎo)的轉(zhuǎn)基因技術(shù)分為SSC體內(nèi)介導(dǎo)轉(zhuǎn)基因技術(shù)和體外介導(dǎo)轉(zhuǎn)基因技術(shù)。SSC體內(nèi)介導(dǎo)轉(zhuǎn)基因技術(shù)即利用表達(dá)載體攜帶外源基因，借助于表達(dá)載體的特殊作用和基因?qū)敕椒?，使外源基因進(jìn)入SSC并整合到基因組中，以產(chǎn)生攜帶有外源基因的精子，最終制備轉(zhuǎn)基因動物[32]。在研究中雖然有轉(zhuǎn)基因的后代產(chǎn)生，但Virginie等[33]認(rèn)為睪丸中包含精原干細(xì)胞到精子不同階段的存在形式，外源基因在整合時不一定發(fā)生在精子形成的什么階段，且SSC體內(nèi)介導(dǎo)轉(zhuǎn)基因技術(shù)效率很低，產(chǎn)生正常精子的效率更低。與SSC體內(nèi)介導(dǎo)轉(zhuǎn)基因技術(shù)相比，SSC體外介導(dǎo)轉(zhuǎn)基因技術(shù)的應(yīng)用效率更高。利用體外培養(yǎng)的SSC進(jìn)行轉(zhuǎn)基因來獲得所需后代，主要有以下幾種方法：一種是將攜帶目的基因的SSC通過體外誘導(dǎo)分化為精子，然后與卵子體外受精后移植到受體動物體內(nèi)產(chǎn)生表達(dá)目的基因的后代；另一種是將轉(zhuǎn)基因的SSC移植到同種不可育或免疫缺陷雄性動物睪丸內(nèi)產(chǎn)生表達(dá)目的基因的精子，再通過自然交配或體外受精產(chǎn)生后代。有研究指出，有些動物通過異種移植精原干細(xì)胞也可以產(chǎn)生供體精子，但是受體動物都是未成熟且內(nèi)源性精子發(fā)生已破壞的免疫缺陷動物[32]。據(jù)此，是否可以利用未成熟、不育且免疫缺陷的異種動物睪丸來為SSC提供體內(nèi)精子發(fā)生的良好微環(huán)境，而后收集精液體外受精來得到所需后代，是一個有待研究的問題。由于SSC的體外培養(yǎng)體系還不夠完善，使SSC能長期培養(yǎng)、傳代而不分化還處于探索階段，技術(shù)水平也比較滯后，還須進(jìn)一步深入研究。

5 結(jié)語

目前，小動物精原干細(xì)胞的研究進(jìn)展比較顯著，精原干細(xì)胞可在體外培養(yǎng)較長時間，并且能進(jìn)行基因操作和移植。由于精原干細(xì)胞目前還沒有特異性標(biāo)志物，在動物體內(nèi)含量極少，且受限于技術(shù)條件，大型動物精原干細(xì)胞的研究還比較緩慢，探索道路也比較漫長。但精原干細(xì)胞的應(yīng)用潛能是不可忽視的，其研究在醫(yī)學(xué)、干細(xì)胞生物學(xué)、分子細(xì)胞生物學(xué)和發(fā)育生物學(xué)等領(lǐng)域都具有重要的應(yīng)用前景。

[1]Dym M, Kokkinaki M, He Z. Spermatogonial stem cells:mouse and human comparisons[J].Birth Defects Res C Em?bryo Today,2009,87(1):27-34.

[2]Clermont Y.Spermatogenesis in man.A study of the spermato?gonial population[J].Fertil Steril,1966,17(6):705-721.

[3]Hermann B P,Sukhwani M,Hansel M C,et al.Spermatogoni?al stem cells in higher primates:are there differences from those in rodents[J]?Reproduction,2010,139(3):479-493.

[4]De Rooij D G.Proliferation and differentiation of spermatogo?nial stem cells[J].Reproduction,2001,121(3):347-354.

[5]張學(xué)明,李德雪,于家傲,等.精原干細(xì)胞的生物學(xué)特性[J].細(xì)胞生物學(xué)雜志，2006,(1):37-41.

[6]李碧春,周冠月,吳洪,等.雞睪丸細(xì)胞體外分離培養(yǎng)初探[J].揚(yáng)州大學(xué)學(xué)報（農(nóng)業(yè)與生命科學(xué)版）,2007,28(1):21-25.

[7]Herrid M,Vignarajan S,Davey R,et al.Successful transplan?tation of bovine testicular cells to heterologous recipients[J].Reproduction,2006,132(4):617-624.

[8]Honaramooz A,Behboodi E,Megee S O,et al.Fertility and germline transmission of donor haplotype following germ cell transplantation in immunocompetent goats[J].Biol Reprod,2003,69(4):1260-1264.

[9]Honaramooz A,Megee S O,Dobrinski I.Germ cell transplan?tation in pigs[J].Biol Reprod,2002,66(1):21-28.

[10]張秀娟,李莉,衛(wèi)恒習(xí),等.小鼠精原干細(xì)胞分離培養(yǎng)條件的優(yōu)化[J].華南農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報,2012,33(1):88-90.

[11]孫大林,張新東.精原干細(xì)胞增殖和分化相關(guān)因子的研究進(jìn)展[J].中華男科雜志,2010,1(3):268-272.

[12]陳曉宇,朱志偉,于福先,等.湖羊精原干細(xì)胞體外培養(yǎng)[J].浙江農(nóng)業(yè)學(xué)報,2010,22(5):580-584.

[13]Brinster R L.A method for in vitro cultivation of mouse ova from two-cell to blastocyst[J].Exp Cell Res,1963,32:205-208.

[14]Araki Y,Sato T,Katagiri K,et al.Proliferation of mouse spermatogonial stem cells in microdrop culture[J].Biol Re?prod,2010,83(6):951-957.

[15]霍龍,張巖,吳應(yīng)積.微滴培養(yǎng)技術(shù)的新應(yīng)用[J].生物技術(shù)通報,2011,(9):59-62.

[16]冉競超.精原干細(xì)胞的有效分離及體外擴(kuò)增方法的研究[D].楊凌:西北農(nóng)林科技大學(xué),2012.

[17]Shinohara T,Avarbock M R,Brinster R L. β1-and α6-integ?rin are surface makers on mouse spermatogonia stem cells.Proc Natl Acad Sci USA，1999,96(10):5540-5549.

[18]Ryu B Y,Orwig K E,Kubota H,et al.Phenotypic and func?tional characteristics of spermatogonial stem cells in rats[J].Dev Biol,2004,274:158-170.

[19]魏剛,張樹成,賀斌,等.小鼠精原干細(xì)胞的組織形態(tài)學(xué)及免疫組織化學(xué)鑒定[J].生殖醫(yī)學(xué)雜志,2012,21(2):180-183.

[20]謝松松,王菊,王寶峰,等.Oct-4在精原干細(xì)胞定向誘導(dǎo)分化中的表達(dá)[J].農(nóng)墾醫(yī)學(xué),2010,32(2):102-107.

[21]Oulad-Abdelghani M,Bouillet P,Decimo D,et al.Character?ization of a premeiotic germ cell-specific cytoplasmic protein encoded by Stra8,a novel retinoic acid-responsive gene[J].J Cell Biol,1996,135(2):469-477.

[22]Koubova J,Menke D B,Zhou Q,et al.Retinoic acid regu?lates sex-specific timing of meiotic initiation in mice[J].Proc Natl Acad Sci USA,2006,103(8):2474-2479.

[23]Naughton C K,Jain S,Strickland A M,et al.Glial cell-line derived neurotrophic factor-mediated RET signaing regulates spermatogonial stem cell fate[J].Biol Reprod,2006,74(2),314-321.

[24]Ohta H,Yomogida K,Dohmac K,et al.Regulation of prolifer?ation and differentiation in spermatogonial stem cells:the role of c-kit and its ligand SCF[J].Development,2000,127(10):2125-2131.

[25]Abaskharoun M,Bellemare M,Lau E,et al.Expression of hy?aluronan and the hyaluronan-binding proteoglycans neurocan,aggrecan,and versican by neural stem cells and neural cells derived from embryonic stem cells[J].Brain Res,2010,1327:6-15.

[26]Yoshida S,Takakura A,Ohbo K,et al.Neurogenin delineates the earliest stages of spermatogenesis in the mouse testis[J].Dev Biol,2004,269(2):447-458.

[27]Kanatsu-Shinohara M,Toyokuni S,Shinohara T.CD9 is a sur?face maker on mouse and rat male germline stem cells[J].Bi?ol Reprod,2004a,70:70-75.

[28]Raverot G,Weiss J,Park S Y,et al.Sox3 expression in un?differentiated spermatogonia is required for the progression of spermatogenesis[J].Dev Biol,2005,283:215-225.

[29]Anderson R,Schaible K,Heasman J,et al.Expression of the hemophilic adhesion molecule,Ep-CAM,in the mammalian germ line[J].J Reprod Fert,1999,116(2):379-384.

[30]Luo J P,Megee S,Rathi R,et al.Protein gene product 9.5 is a spermatogonia-specific marker in the pig testis:Applica?tion to enrichment and culture of porcine spermatogonia[J].Mol Reprod Dev,2006,73(12):1531-1540.

[31]Brinster R L,Zimmermann J W.Spermatogenesis following male germ-cell transplantation[J].Proc Natl Acad Sci USA,1994,91(24):11298-11302.

[32]邱峰龍,李碧春.精原干細(xì)胞介導(dǎo)法制備轉(zhuǎn)基因羊的研究進(jìn)展[J].中國畜牧獸醫(yī),2012,39(12):144-149.

[33]Virginie O,Francois C.The spermatogoniaI stem cell:From ba?sic knowledge to transgenic technology[J].Biochem Cell Biol,2005,37(2):246-250.