杜建中， 趙欣梅， 王長彪， 郝曜山， 王亦學， 張歡歡， 孫 毅

山西省農業(yè)科學院生物技術研究中心，太原030031

自20世紀80年代植物基因工程誕生以來，人們一直將標記基因與目的基因共同導入轉化細胞或植株，其中標記基因(marker gene)在植物的遺傳轉化過程中的作用是區(qū)分轉化和非轉化細胞(植株)，一旦轉基因植株再生成功，標記基因便失去作用［1］。目前使用較為廣泛的標記基因有兩類:除草劑抗性基因和抗生素抗性基因。隨著轉基因作物的商品化以及種植面積的逐年擴大，人們擔心轉基因農作物中的除草劑抗性基因可能會隨花粉漂移而傳遞至雜草，從而使這些雜草對除草劑產生抗性，產生所謂的“超級雜草”而難以清除;另外轉基因食品中的抗生素抗性基因可能通過轉染腸道細菌從而造成人體內的病菌對這些抗生素產生耐藥性，而產生出一些難以控制的超級細菌［2］。目前還沒有確鑿可信的證據(jù)證明這些擔憂是多余的，但抗性標記基因(resistant marker gene)潛在的生態(tài)環(huán)境和食用安全性的爭議卻越來越多。因此，從科學的態(tài)度出發(fā)，尋找適用于植物轉化的安全標記基因無疑會是解決這一問題的最佳途徑。

目前所發(fā)現(xiàn)的安全標記基因有以下幾類:①代謝產物選擇標記，如6-磷酸甘露糖異構酶(PMI)基因［3～7］、花青素合成酶(ANS)基因［8，9］、木糖異構酶基因(xylA)［10～13］等;②耐脅迫基因，如山菠菜膽堿單氧化物酶(CMO)基因［14～16］、甜菜堿醛脫氫酶(BADH)基因［17～22］;③代謝產物合成途徑中調控因子基因，如玉米花青素合成途徑中的r/b調控基因家族和c1/p1調控基因家族［23，24］;④綠色熒光蛋白(GFP)基因［25～30］等。這些較安全的標記基因中，花青素合成酶類基因由于可以產生可視的轉化體表型變化，因而作為標記用于篩選轉化體具有其他安全標記基因所不具備的優(yōu)勢。

花青素是一類在植物體內合成的水溶性天然色素，屬類黃酮化合物，很少以游離狀態(tài)存在，通常是與一個或多個單糖或多糖結合形成花色苷，其群體較大，大約有250 多種［31～34］，而且這些花青素類物質的顏色還會隨所處環(huán)境pH的變化而變化，pH＜7呈紅色，pH在7～8時呈紫色，pH ＞11時呈藍色［31］，鄭智［35］還發(fā)現(xiàn)，木芙蓉在離體培養(yǎng)條件下，溫度、光照和金屬離子對植株的著色有顯著影響。結構基因或調控基因對花青素的合成起調節(jié)作用，這些基因表達水平的變化決定了花青素在植物細胞內積累量的改變，從而使植物表型產生不同的色彩變化［36］。這種顏色變化很容易用肉眼分辨，有利于作為對轉化體選擇的依據(jù)，因此控制花青素合成的酶類和調控因子基因可作為報告基因用于轉基因植物研究［37］。目前用于此類轉化研究所涉及的植物包括小麥、煙草、水稻、馬鈴薯、草莓和花卉等。有關花青素相關基因的研究，包括研究花青素合成的結構基因和調控基因的作用、轉化體表型的變化、花青素生物合成途徑中各種酶的活性以及這些基因作為標記基因轉化植物的可行性等，均涉及到根據(jù)轉化體顏色變化來篩選得到轉化體，因而這些研究進展從不同角度為可視安全標記花青素合成酶類基因及調控基因在植物轉化研究中的應用提供了依據(jù)。

1 與花青素合成酶類有關的轉化研究

1.1 查爾酮合成酶

花青素生物合成代謝過程十分復雜，僅參與合成的主要催化酶類就有多個，其中查爾酮合成酶(chalcone synthase，CHS)是植物花青素合成途徑中類黃酮物質合成的第一個酶。據(jù)統(tǒng)計，國內外科學家已經從不同植物中克隆得到一百多個CHS基因的序列［38～40］。許多研究證明查爾酮合成酶基因的表達對紫外光照射、真菌侵染等外界刺激敏感，而且具有花特異性部位表達的特性，其表達量的高低可引起植物花色的深淺變化［41～43］。因此查爾酮合成酶合成產物顏色的變化能作為可視化標記基因來研究植物的遺傳轉化。

在轉化研究方面，Jez等［39］將用紫外照射的來自歐芹(Petroselinum hortense)的細胞懸浮培養(yǎng)物的DNA片段(與CHS mRNA互補)插入質粒pBR322，并用于轉化大腸桿菌菌株RR1，發(fā)現(xiàn)在照射的細胞中，CHS mRNA含量發(fā)生劇烈變化。Elomaa等［44］將含有編碼非洲菊CHS的全長反義cDNA連接到卸甲農桿菌，再將非洲菊葉柄切片與上述農桿菌共培養(yǎng)，發(fā)現(xiàn)在啟動子CaMV 35S驅動下，反義cDNA抑制了轉化體中花青素苷的合成，一些轉化體的花色發(fā)生了顯著變化。由于花青素衍生物的積累，百合科油點草屬觀賞植物的花被上有許多微紅色斑點，Kamiishi等［45］從這類植物的花被中分離到CHS的全長cDNA克隆，并定名為TrCHS1，接著他將以TrCHS1為靶標的一個RNA干擾子載體采用農桿菌介導法轉化到油點草植株中，旨在使油點草的花色發(fā)生變化。研究結果發(fā)現(xiàn)，轉化體依據(jù)花被顏色可分成3類，第一類，花被的微紅斑點數(shù)與非轉化植株相同;第二類，微紅斑點數(shù)比非轉化植株少;第三類，花被完全呈白色，沒有斑點出現(xiàn)。

1.2 查爾酮異構酶

查爾酮異構酶(CHI，chalcone isomerase)是花青素合成途徑中的另一個關鍵酶，產物為二羥基黃烷酮。Mehdy等［46］用真菌誘導子處理菜豆(Phaseolus vulgaris L.)的細胞培養(yǎng)物，并提取其mRNA構建了11個基因文庫，用菜豆CHI基因產物的抗血清篩選到兩個陽性克隆，這是最早利用抗體技術從法國菜豆中分離到的CHI基因。之后，vanTunen等［47］在矮牽牛中發(fā)現(xiàn)存在兩個CHI基因，基因A和基因B，并證明基因A在花冠和成熟的雄蕊中都可表達，而基因B僅在未成熟的花藥中表達，屬于位點特異表達差異。2003年，Norimoto等［48］根據(jù)酶功能將植物CHI蛋白基因家族分成兩大類，一類酶只能將查爾酮異構化為(2S)-黃烷酮，另一類酶可將查爾酮或6'-脫氧查爾酮都異構化為(2S)-5-脫氧黃烷酮。

將CHI基因作為標記基因的轉化研究方面，Muir等［49］用來自牽?；ǖ?CHI基因構建了pBBC50和 pSJ89兩個質粒轉農桿菌菌株LBA4404，轉化番茄(var.FM6203)，經分子檢測得到轉化植株，對后代植株的研究中發(fā)現(xiàn)轉基因番茄株系的果皮中黃酮醇比對照增加78倍，轉基因植株與對照植株的表型間沒有明顯差異。Nishihara等［50］從煙草中分離到編碼CHI基因的cDNA，根據(jù)序列分析，將可干擾其轉錄或表達的RNA干擾子用農桿菌介導法轉入煙草植株，研究發(fā)現(xiàn)，轉化植株的花瓣中色素沉積減少，黃酮醇類的組分也發(fā)生了變化，花粉中積累大量查爾酮，呈黃色，證實通過遺傳轉化方法抑制CHI基因可產生明顯的表型差異。Li等［51］從風毛菊屬植物的細胞培養(yǎng)物中分離到CHI基因，并轉化煙草植株，采用正反雙向35S啟動子調控對CHI基因進行調控，引入正向35S啟動子的轉化植株中黃酮類物質積累是對照植株的5倍，主要是由于蕓香苷的積累。而由于反向啟動子抑制了內源CHI基因的表達，引入反向35S啟動子的轉化植株中只積累較少量的黃酮類物質。Zhou等［52］從牡丹花中分離到CHI基因并轉化煙草植株，獲得了T1轉基因植株，表型和色素分子檢測證明，轉化植株體內黃酮醇和黃酮的積累量是對照植株的3倍，花青素苷和花的顏色強度均有顯著減少。

1.3 黃烷酮3-羥化酶

黃烷酮3-羥化酶(F3H，flavanone 3-hydroxylase)催化黃烷酮脫羥基生成黃酮醇。Martin等［53］最早從金魚草中分離到這個酶，在大豆、玉米、茄子、苜蓿、蘋果、康乃馨等不同植物中，黃烷酮3-羥化酶多以單拷貝形式存在［54］。

Amir等［55］研究發(fā)現(xiàn)，康乃馨品種(Eilat)由于缺少黃烷酮3-羥化酶和類黃酮-3'，5'-羥化酶，致使花卉只有橙色表型。它們將F3H的反義cDNA導入康乃馨品種Eilat，試圖阻止編碼F3H的基因的表達，在轉化體中發(fā)現(xiàn)，一些花朵原有的橙色或微紅色變淡，一些花朵失去原有顏色，只有一些色素痕跡存在，轉化體比對照香味更濃。Takashi等［56］利用兩個不同的異源表達系統(tǒng)，釀酒酵母的微粒體部分和轉基因煙草植株，研究從龍膽植物花瓣中分離的F3H和黃酮合成酶Ⅱ(GtFSⅡ)的酶活性。在酵母中表達的重組體GtF3'H對幾個黃酮類底物在3'位置顯示羥基化活性，而表達GtF3'H的轉基因煙草植株中花青素濃度略有增加，花的顏色也加深;酵母中，GtFSⅡ重組體能夠從黃烷酮合成黃酮，而在轉基因煙草植株中，花色素苷和花的顏色明顯減少。Jiang等［57］構建了一個可編碼一個發(fā)夾F3H RNA的RNAi基因沉默載體，將攜帶F3H RNAi載體的農桿菌菌株GV3101注射到已開花授粉仍在植株上的草莓里，注射10 d后觀察草莓的表型，同時進行RT-PCR和Northern雜交分析，結果證明，同未注射的對照相比，轉化果中F3H減少了70%，HPLC-MS分析證明，果中花青素含量劇烈減少，黃酮類物質也減少了。

1.4 二氫黃酮醇4-還原酶

二氫黃酮醇4-還原酶(dihydroflavonol 4-reductase，DFR)在花青素合成途徑中催化二氫黃酮醇類底物發(fā)生還原反應，生成無色的原花色素。Heller等［58］研究發(fā)現(xiàn)DFR基因在植物中多以單拷貝形式存在，而Shimada等［59］證明在有些植物中存在多個拷貝的DFR基因，不同拷貝間表現(xiàn)出各自的組織特異性表達特征。例如在百脈根植物中，DFR1在結節(jié)、根、莖、葉、花和豆莢中都可表達，而DFR2在除了葉以外的其他組織中表達，DFR4和DFR5在除了結節(jié)以外的其他組織中能表達，但是DFR3只在莖和葉中表達。

Rosati等［60］采用農桿菌介導法將來自金魚草(Antirrhinum majus)的DFR基因和紫羅蘭(Matthiola incana)的花青素合成酶基因(MiANS)順序轉化到連翹(Forsythiax intermedia cv‘Spring Glory’)植株中，兩個基因共轉化的植株的花瓣呈現(xiàn)一種古銅色+橙色的新顏色，這是因為花青素衍生物-花青素苷在野生的胡蘿卜素黃色的背景基礎上重新積累的結果。單個基因轉化的個體中花瓣的顏色沒有改變，證明連翹花瓣中花青素苷合成的后面幾個步驟是受多級控制的。Mori等［61］認為，DFR是藍色或紫色花色表達的關鍵酶，他們從蔓長春花的花瓣中克隆得到DFR基因的全長cDNA，并定名為VmFH1，當將其轉化到矮牽?；ㄖ仓曛袝r，一些轉化體的花色發(fā)生了顯著變化，花色由紅色變成含深紫色部分的深紅色，這是因為轉基因植株的花瓣中積累了3'，5'-羥基花青素苷的緣故，證明蔓長春花的DFR在其他植物中仍具有活性。

1.5 花青素合成酶

花青素合成酶(anthocyanidin synthase，ANS)因其可催化原花色素底物產生氧化反應而生成花青素苷，故又稱作無色花色素雙加氧酶，是花青素合成途徑中的關鍵酶之一［62～64］。Menssen 等［65］最初是從玉米的一個突變體A2中克隆到花青素合成酶的。截至目前所得到的ANS基因序列大多數(shù)包含有1個內含子和2個外顯子。

此外，ANS基因在植物體內的表達具有組織特異性，Rosati等［66］研究證明，金鐘連翹中的花青素合成酶只在金鐘連翹的萼片中表達，而在花藥花瓣中卻沒有ANS的表達。Noriko等［67］采用RNAi技術，將RNA片段導入夏堇植物體，以抑制夏堇體內ANS的表達，結果發(fā)現(xiàn)，轉基因植株由于缺少花青素合成，其花色整體由藍紫色變成了白色。Reddy等［68］克隆得到一個水稻 ANS cDNA，并用于轉化一種水稻突變體植株，這種突變體只在其果皮中積累原花青素，但所有組織中都沒有花青素苷的存在。轉基因突變體植株中類黃酮和花青素苷積累增加，而原花青素相應減少，種皮呈現(xiàn)出紫紅色。祝欽龍［69］克隆到彩葉草花色素合成酶基因家族(SsANS)并用于轉化煙草W38植株，發(fā)現(xiàn)該基因在花中表達最強，在葉片中的表達較弱，在莖和根中不表達。導入外源基因使煙草植株的花色和葉色都發(fā)生了不同的變化。

2 與花青素合成途徑有關的調控因子的轉化研究

隨著社會發(fā)展，人們對日常生活環(huán)境美化的要求不斷提高，特別是對花卉植物鑒賞能力的變化促使花卉市場的擴大和花卉植物研究的日益深入，加之對花青素次生代謝產物在人類健康方面有益影響的進一步了解，一些與花青素的代謝合成途徑及其相關的基因調控的研究越來越引起科學界的興趣［70］。許志茹等［71］在總結前人的研究時，將已知的花青素合成調控因子分成三類:bHLH、MYB 和 WD40。夏玉鳳等［72］研究認為，大多數(shù)物種中，其花青素的合成都是由上述三類轉錄因子的復合體調控的，但也有個別植物其花青素合成僅需要一個調控因子就能激活，如在玉米中，鞣紅的生物合成只要調控因子MYBP1存在就能被激活。

2.1 調控因子共轉化

所有已知的花青素合成調節(jié)因子中，以對玉米(Zea mays L.)花青素苷合成調節(jié)基因的研究相對較為詳細。在玉米中，根據(jù)編碼花色素苷基因的轉錄因子的不同，可將玉米中這類調節(jié)基因分為r/b基因家族和 cl/pl基因家族［73］。Maike等［74］研究證明，r/b基因家族編碼的是bHLH類轉錄因子，組成龐大，成員眾多，包含有R-sc、Lc、Sn和B等100多個基因。而編碼MYB類轉錄因子的cl/pl基因家族只包含包括Cl和Pl兩個基因。如上所述，這兩個基因家族的基因都不能單獨地行使調節(jié)功能，通常是幾個基因結合在一起共同作用來調控花青素的生物合成［75］。Doshi等［76］將玉米花青素調控基因C1和B-Peru基因同時導入大麥植株，并在大麥的不同組織特異性啟動子驅動下來研究大麥體內花青素的合成，試圖通過大麥幼胚等器官或組織的顏色變化來判斷這些啟動子的組織特異性表達和驅動能力。Doshi等［77］進一步采用基因槍法將花青素苷合成調控基因C1和B-Peru導入小麥和黑小麥植株中，兩個基因受胚特異性表達啟動子Ltp1的控制，在沒有選擇壓時獲得了轉基因植株，小麥和黑小麥中可選擇標記基因的轉化率分別為0.93%和1.55%。但只在3個轉基因小麥株系和1個轉基因黑小麥株系的T1代成熟種子中觀察到有花青素苷沉積的胚，可能的原因是多位點插入或轉基因重組影響了花青素苷合成基因的表達。C1和B-Peru基因可以作為小麥和黑小麥的可視化標記。在研究調節(jié)因子的協(xié)同作用方面，Han等［23］利用玉米花青素合成的調控基因Pl和Lc分別或共同轉化匍匐剪股穎植物時發(fā)現(xiàn)，分別轉化時，兩個基因單獨調控花青素的合成，所以轉基因植株上出現(xiàn)紫色的位置不確定，色強也有差異;若用兩個因子共同轉化時，轉基因植株全身都呈現(xiàn)出紫色。

2.2 花青素合成基因表達的組織特異性調控

van de Meer等［78］為了研究涉及參與指導花特異性和可紫外誘導表達的查爾酮合成酶的5'側鏈調節(jié)區(qū)的調節(jié)序列，構建了一個嵌合基因，包含來自矮牽牛(Petunia hybrida)的 chs A啟動子(V30)、作為報告基因的氯霉素乙酰轉移酶結構基因序列(cat)以及來自矮牽?；ǖ腸hs A終止子區(qū)(V30)。將這個嵌合基因和啟動子5'末端缺失的嵌合基因構建到帶有Ti質粒的載體上，并用于轉化矮牽牛植株，隨后測定CAT活性。結果表明含有順式作用元素的長220 bp的chs A啟動子片段的導入，賦予轉基因植株花特異性和可紫外誘導的表達;當啟動子為-67～+1的片段時，轉基因矮牽?；ㄈ阅芴禺愋员磉_，但可紫外誘導部分不表達。與其他植物品種的chs基因的啟動子序列進行比較，結合缺失分析和凝膠阻滯鑒定的結果，強烈證明矮牽牛中TACPyAT重復(-59和-52)參與了chs A基因的器官特異性表達的調節(jié)。楊翅春等［79］將油菜的花瓣特異性啟動子XY355與玉米花青素調節(jié)基因Lc共同構建的植物表達載體pXY60，以根癌農桿菌(Agrobacterium tumefaciens)介導法分別轉化煙草(Nicotiana tabacum)和矮牽牛植株，觀察轉基因植株后代的花色發(fā)現(xiàn)，與非轉化植株的花色比較，轉基因植株花色都有所加深，轉基因煙草的花色由淡紅色變成了紅色，轉基因矮牽牛的花色由白色變化為淺紫色。趙欣梅等［80］利用花青素合成調控因子C1/B-Peru構建了兩個植物轉化載體，一個載體中調控因子受胚特異性啟動子控制，另一個載體中調控因子受到CaMV35S啟動子控制。分別轉化玉米幼胚，證明兩個載體都能在玉米幼胚細胞中瞬時表達。黃艷嵐等［81］克隆到馬鈴薯花青素轉錄激活基因(stmyc)，并證明該基因在馬鈴薯中呈組成型表達。Kortstee等［82］研究發(fā)現(xiàn)來自蘋果的一個轉錄因子基因MYB10的突變體等位基因可以誘導植株全身的花青素苷合成，將該基因(包括其上游的啟動子、基因編碼區(qū)和終止子序列)導入蘋果、草莓和馬鈴薯植株，檢測其是否能夠用作一個可視的選擇標記基因以替代化學合成的標記基因，如卡那霉素抗性標記基因。轉化后，他們標記紅色愈傷、紅色嫩枝和紅色的生長良好的植株，從蘋果外植體上取樣綠色和紅色的枝條，用PCR法檢測MYB10基因的存在。結果證明蘋果外植體的紅色枝條總是含有MYB10基因，但含有MYB10基因的枝條不都是紅色的。轉化的草莓植株顯示在葉片和根部有花青素苷的積累，但在馬鈴薯中沒有觀察到花青素苷的積累，即使它帶有MYB10基因也是如此。不過馬鈴薯的葉片和根部含有比對照高4倍的花青素苷，因此MYB10基因可以在蘋果、草莓和馬鈴薯中用作選擇標記基因來替代卡那霉素抗性標記基因。

2.3 色素含量和植株表型的調控

Pandey等［83］開發(fā)了一種轉化煙草植株愈傷培養(yǎng)方法以表達黃酮醇特異性轉錄因子At-MYB12，目標是得到一個可用的蕓香苷資源。轉基因愈傷表現(xiàn)為提高了生物合成途徑中相關基因的表達，導致黃酮醇的積累增加，尤其是蕓香苷。在愈傷生長的每一個點，轉基因愈傷中蕓香苷含量都比野生型對照高幾倍。Butelli等［84］以Delila和Roseal基因為供體，轉化番茄植株，得到了轉化植株，轉化體中兩個調節(jié)基因在果實特異E8啟動子驅動下，花青素合成水平提高，使番茄果實的顏色加深，成為紫色果實。Lloyd等［85］用玉米的花青素合成調節(jié)基因Lc來轉化煙草，發(fā)現(xiàn)轉基因煙草植株的花色發(fā)生了變化，由最初的淡紅色變成轉化后的深紅色。與此相反，Kim等［86］將來自玉米的調節(jié)基因C1用于轉化煙草，證明轉化植株的形態(tài)表型不僅發(fā)生了變化，而且轉化體的花瓣顏色變得更淡了。早在1990年，Napoli等［87］報道在將查爾酮合成酶基因導入紫色矮牽牛中，轉化后代中約有42%的轉化植株的花色是白色，或是紫白嵌合花色，與Kim等的研究結果接近。Napoli等還認為發(fā)生這種現(xiàn)象的可能原因是導入外源CHS基因后，牽?；ㄖ仓陜仍碈HS基因的表達受到了抑制，并將這種由于外源基因轉入而導致內源同源基因以及外源基因共同受到抑制的現(xiàn)象稱為共抑制。Shimada等［88］利用Hf1和Hf2調控因子基因轉化矮牽牛，原本粉紅色的牽牛花的轉化植株中出現(xiàn)了紫、粉紅色的嵌合花色;Liu等［89］將來自擬南芥的轉座子Tag1序列插入到啟動子CaMV 35S和玉米調節(jié)基因R中間，并用于轉化煙草植株，發(fā)現(xiàn)轉化體中出現(xiàn)多種嵌合花色，但都未說明出現(xiàn)這種現(xiàn)象的原因。

2.4 與其他性狀基因連鎖轉化

Liu等［90］認為，將可視標記基因與有關性狀連鎖，就能夠明確分辨出含有這個性狀的轉基因種子，遺傳修飾材料很容易與非轉基因材料區(qū)分開來。來自玉米的調控花青素苷生物合成途徑的基因負責指導紫色色素合成，能用于產生具有獨特的、易于識別表型的轉基因植株。因此用一個種子特異性玉米球蛋白啟動子來驅動兩個轉錄因子基因(Bp和C1)的表達，這兩個因子在胚和糊粉層組織中調節(jié)花青素苷生物合成途徑，使玉米種子具有明顯的紫色色素沉積。將這兩個基因與除草劑抗性標記基因一起構建載體并轉化玉米植株，結果證明體細胞胚得到了色素沉積，再生的轉基因植株帶有色素沉積種子，而且整合的DNA與除草劑抗性發(fā)生共分離，說明這兩個調節(jié)因子基因可用作玉米轉化的標記基因。宮硤等［24］以含有報告基因Bi和C1以及篩選標記基因epsp的植物表達載體pBAC9009為供體，以玉米自交系501的幼胚為受體，用基因槍法進行轉化，幼胚分化再生植株經草甘膦抗性篩選，獲得了75株抗性植株，其中43株結實獲得種子，T0代植株有18株在苗期或生長階段表現(xiàn)局部或全紫色，8個結實果穗有零星的紫色種子，從外觀上可直接確認為轉化植株。PCR和RT-PCR的分子檢測及花青素含量分析表明，葉片和籽粒為紫色的玉米植株中外源目的基因已整合并且高效表達，即紫色表型與分子檢測的結果高度一致。巴超杰等［91］以草甘膦抗性基因epsps為標記基因，在原核Kanr基因兩側引入Cre(環(huán)化重組酶)基因識別的Lox-P位點，同時以編碼花青素合成轉錄因子的Bi和Cl基因為可視化選擇報告基因，構建了Bt殺蟲蛋白基因Cry1Ab/c的可視化跟蹤表達載體pBAC9017。用PDS1000/He基因槍轉化玉米(Zea mays)自交系501的幼胚和胚性愈傷組織，獲得147個草甘膦抗性的玉米再生植株。Qiu等［92］為了增加產橡膠蒲公英植株的價值，通過讓來自擬南芥植物的轉錄因子調控花青素苷色素1(AtPAP1)的異源表達來開發(fā)生產橡膠蒲公英品種的紅色/紫色植株。轉基因植株的營養(yǎng)組織中總的花青素苷含量比對照平均高48倍，但色素沉淀是一個例外，轉基因植株的表型與對照不相上下，生長活力也差不多。在5個轉基因系中，AtPAP1基因的表達水平與總花青素苷含量高度相關，而此時天然橡膠仍正常存在，轉基因并未影響天然橡膠的生產。

3 討論

花青素的生物合成在自然界有著豐富的功能，其中重要的一點是構成多彩的花色，蟲媒植物依賴其自身的花色吸引昆蟲為其傳花授粉。此外，花青素合成的各級產物對人類來說，不僅是無毒無害，而且還具有許多重要的生理功能。Halliwell［93］認為花色苷具有清除氧自由基的作用，因此在一些疾病的預防方面具有重要功能［94～96］。用花青素合成酶類基因或調控因子基因作為標記基因進行植物轉基因研究，能夠減少人們對使用抗生素抗性基因或抗除草劑基因作為標記基因所產生的擔憂。大量的研究結果證明，植物導入花青素合成酶或合成調節(jié)因子可引起轉化體著色發(fā)生改變，從而使人們無需借助任何設備就很容易方便地區(qū)分轉化體和非轉化體，因此花青素合成途徑中的結構基因或調節(jié)基因用于轉化植物具有如下優(yōu)勢:①無毒無害且有利于人類健康，屬安全標記基因;②可以直觀地從轉化群體中通過轉化體顏色的改變篩選到轉化事件，從而使繁瑣重復的轉基因個體篩選工作變得方便快捷，大大縮減傳統(tǒng)篩選方法所需的人力和物力，同時有效降低檢測成本［97］。此外，一些研究還表明，調節(jié)色素類基因的表達，積累的色素不僅使轉基因植株生產產品附加值增加［92］，還能起到防治植物病蟲害的效果，Pandey等［83］發(fā)現(xiàn) AtMYB12轉基因植株積累增加的蕓香苷，對斜紋夜蛾和棉鈴蟲幼蟲來說是致死的或抑制其生長，用該轉錄因子轉化植株，生成的蕓香苷可防治蟲害。

雖然用花青素合成酶類轉化植物安全、省力，但也有其不足之處，如，花青素合成酶類或控制花青素合成基因的啟動子大多是組織或器官特異性的，因此其轉化載體的構建需要針對轉化研究的目的做合理調配，即花卉植物多選用花特異性啟動子調控，大作物多選用種子或果實特異性轉錄的啟動子。若選用35S啟動子，轉化體的表型將發(fā)生巨大變化，如綠色植物體可能會變成紫色、深紅色、甚至是黃色或無色，其結果是轉化體無法正常進行光合作用;在作物上，若選用種子特異性啟動子調控，會使得對轉化體的篩選延遲到成熟期或收獲期，無法早期做出合理判斷，這將無形中延長研究周期等。然而，這些缺點可以通過精確的實驗設計加以彌補。綜合考慮其利弊，以花青素基因作為報告基因的應用可以大大提高工作效率，節(jié)約檢測成本，對于植物轉基因研究具有重要意義。因此用花青素合成酶類基因轉化植物是一種可視、安全和有效的標記基因，其應用前景十分廣闊。

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