姜李樂，韋多，張翠蓮

（鄭州大學人民醫(yī)院生殖醫(yī)學研究所，鄭州 450003）

在人類生育力保存方面，冷凍保存為輔助生殖技術不受空間、時間的限制提供了可能。胚胎冷凍、卵母細胞冷凍、卵巢組織冷凍是女性生育力保存的3項基本方案。三者各有優(yōu)缺點與局限性，其中卵母細胞冷凍因其特點和難點是現(xiàn)代輔助生殖技術的重要組成之一，廣受關注［1］。介于成熟卵母細胞的來源有限、對低溫非常敏感的特點，提出冷凍紡錘體形成前的第1次減數(shù)分裂前期雙線期（GV期）或第1次減數(shù)分裂中期（MI期）的未成熟卵母細胞。冷凍保存未成熟卵母細胞有著廣闊的發(fā)展前景。本文從冷凍未成熟卵母細胞的優(yōu)勢、冷凍方法及影響因素等方面予以綜述。

一、冷凍未成熟卵母細胞的優(yōu)點

1.與冷凍胚胎相比：冷凍未成熟卵母細胞能夠解決胚胎冷凍臨床應用局限性大的問題。目前胚胎冷凍保存已經(jīng)作為一項成熟有效的輔助生殖技術在臨床上廣泛應用。但胚胎的產(chǎn)生常規(guī)需要行促性腺激素刺激卵巢，提取成熟卵母細胞以及在體外受精等過程。通常需要好幾周甚至幾個月的準備時間，而收集未成熟卵母細胞10d之內(nèi)可以完成。冷凍胚胎并不適合不能延遲放化學治療的晚期惡性腫瘤患者、有激素使用禁忌癥的患者、幼女等［2］。同時，冷凍未成熟卵母細胞還緩解了胚胎冷凍存在的倫理、法律、道德、宗教多方面社會問題［3－4］。

2.與冷凍成熟卵母細胞相比：未成熟卵母細胞的來源更廣，可在月經(jīng)周期任何時間取卵，而成熟卵母細通常僅來源于體外受精（IVF）周期。收集未成熟卵母細胞減少了患者進行超促排卵方案的經(jīng)濟與時間花費，避免了卵巢過度刺激綜合征（OHSS）的發(fā)生。另外，未成熟卵母細胞獲取容易，常規(guī)IVF周期中平均能得到15%～20%的裸化的未成熟卵［5］，多囊卵巢綜合征（PCOS）患者的未成熟卵母細胞，婦科手術穿刺得到未成熟卵母細胞，良性婦科疾病切除的卵巢組織也都可以得到未成熟卵母細胞。成熟卵母細胞染色體排列規(guī)律，胞漿內(nèi)由微管構成的紡錘體結構特殊且溫度敏感性高，冷凍降溫中易解聚，造成非整倍體、雙雌受精發(fā)生率高以及透明帶硬化、受精障礙發(fā)生率增加。而未成熟卵母細胞（GV或MI期）沒有形成紡錘體結構，體積較小且染色體被核膜包繞，GV／MI期卵母細胞染色質(zhì)特定的存在狀態(tài)在凍融中提供了保護，染色體損傷的可能性小，對低溫不敏感，在冷凍過程中易脫水，避免了卵母細胞因紡錘體結構受到低溫或冷凍保護劑的沖擊而導致遺傳物質(zhì)損傷［6］。Al－Khtib等［7］的研究顯示玻璃化冷凍未成熟卵母細胞在一定程度上并不影響基因的印跡表達。與成熟卵母細胞相比，凍存未成熟卵母細胞是更好的選擇［8］。

二、不同時期未成熟卵母細胞特點比較

未成熟卵母細胞包括GV期和MI期兩大類，GV期卵母細胞的典型特征是含有1個巨大的生發(fā)泡，卵母細胞結構中有兩層大的細胞膜，即細胞膜和生發(fā)泡膜。在進行冷凍及復蘇過程中，兩層膜對滲透壓的變化有著較強的緩沖作用，很大程度上降低了GV期卵母細胞胞漿膜崩解率，GV期卵母細胞與MI期相比，更能耐受低溫及冷凍保護劑的影響，MI期卵母細胞因不存在生發(fā)泡的特殊結構，而細胞膜易遭到冷凍破壞［9］。

三、冷凍未成熟卵母細胞的方法選擇

1.程序化慢速冷凍法：程序化慢速冷凍法是一種經(jīng)典的冷凍方法，比較適合體積大的細胞。使用低濃度冷凍保護劑，在程序冷凍儀控制下緩慢降溫使細胞脫水，利用植冰方法越過細胞的超冷階段，進一步啟動脫水過程，在進入液氮前使胞漿處于玻璃化狀態(tài)，實現(xiàn)未成熟卵母細胞低溫保存。但程序化慢速冷凍存在脫水不完全的問題，若未成熟卵母細胞在浸人液氮前還存在小冰晶，小冰晶會在復溫過程驟然膨大損傷胞膜及胞內(nèi)結構，造成細胞致命的傷害。幾十年來，程序化冷凍方法發(fā)展緩慢，其復蘇率較低，發(fā)育潛能相對差，文獻統(tǒng)計的慢速冷凍卵母細胞來源的出生嬰兒僅約百人［10］。

2.玻璃化冷凍法：玻璃化冷凍作為新興技術，其基本原理是高濃度冷凍保護劑溶液以極快的速率降溫，由液態(tài)轉化為類似玻璃形態(tài)的非晶體化固體，這種玻璃化液在低溫時黏稠度很高，但不結晶形成玻璃樣固體，保留了正常的超微結構，維持了細胞內(nèi)外離子、分子分布，很好地解決了程序化冷凍過程中容易去玻璃化和再結晶導致細胞損失的問題。在卵母細胞冷凍方面，Cao等［11］還證明了玻璃化冷凍方法比程序化慢速冷凍卵母細胞的復蘇率、受精率、囊胚形成率高。Smith等［12］的前瞻性對照研究也得到了相似的結論，玻璃化冷凍卵母細胞的胚胎形成率及妊娠率與新鮮卵母細胞相似［13］。根據(jù)薈萃分析的結論，程序化慢速冷凍方法的每枚卵母細胞的出生率為2.3%，玻璃化冷凍方法的每枚卵母細胞的出生率為5.2%。在未成熟卵母細胞冷凍的研究上，羅莉等［14］也得到了未成熟卵母細胞玻璃化凍融組的復蘇存活率、卵體外培養(yǎng)成熟（IVM）成熟率、受精率及卵裂率均高于慢速程序凍融組的結論。Catherine等［15］的研究也支持玻璃化冷凍是優(yōu)于程序化慢速冷凍的選擇。另外，玻璃化冷凍操作簡便，節(jié)省人力時間，不需像程序化冷凍化那樣配備特殊儀器，已經(jīng)成為最有發(fā)展前途的冷凍保存技術［16］。

四、冷凍保護劑的選擇

在冷凍過程中添加冷凍保護劑，達到延長細胞脫水過程，避免冰晶的形成，減少冷凍損傷的作用。分為滲透性冷凍保護劑和非滲透性冷凍保護劑兩大類，滲透性冷凍保護劑通過降低溶液的冰點，增加溶液的粘性，稀釋溶液中的溶質(zhì)［17］，主要有丙二醇（PROH）、二甲基亞砜（DMSO）和乙二醇（EG）等，三者滲透速率為EG＞PROH＞DMSO，非滲透性冷凍保護劑不能通過細胞膜，但可在細胞外形成滲透梯度，引起胞內(nèi)水分外流，主要有蔗糖、海藻糖、葡萄糖和脂蛋白等。蔗糖是過去常用的非滲透性冷凍保護劑，添加蔗糖可以提高卵母細胞細胞外液滲透壓，促進脫水，降低滲透性冷凍保護劑進入到卵母細胞內(nèi)的量，又能在解凍時預防滲透性休克。早期曾認為冷凍保護劑會導致脫氧核糖核酸突變，DMSO將對成熟卵母細胞紡錘體造成較大損害，但新近Milliken等［18］的評估結果認為DMSO無遺傳毒性，EG沒有直接的遺傳毒性，PROH有導致DNA損傷的可能。現(xiàn)階段未成熟卵母細胞冷凍的方案研究開始關注降低冷凍保護劑的毒性，旨在使用最小濃度的冷凍保護劑以獲得較穩(wěn)定的解凍復蘇率。現(xiàn)在普遍認為EG能夠有效縮短復蘇過程中的清除時間，是較為理想的冷凍保護劑。Tharasanit等［19］報道采用逐步分段式冷凍保護劑在未成熟卵母細胞冷凍中獲得了較好的結果。最新Somfai等［20］的研究結果表明聯(lián)合17.5%PROH和17.5%的EG能夠確保良好的未成熟卵母細胞復蘇存活率，且在后期發(fā)育中未觀察到毒性效應。

五、冷凍載體的選擇

玻璃化技術的冷凍載體依據(jù)冷凍物質(zhì)是否直接接觸液氮分為開放性載體和封閉性載體。使用開放性載體，標本直接接觸液氮，冷凍復蘇速度快、效率高，操作簡便，但潛在的微生物污染風險是其最大缺陷［21］。封閉性載體，如拉細麥管和冷凍鉤的出現(xiàn)杜絕了污染風險，但較長的封閉操作時間增加了未成熟卵母細胞在玻璃化液體內(nèi)的留存時間，降低了冷凍效率，且復雜的操作對人員要求更高?；仡櫦韧邢薜膸醉椨嘘P使用開放性載體冷凍未成熟卵母細胞對其復蘇存活率、未成熟卵體外培養(yǎng)成熟（IVM）后成熟率、受精率的研究，尚認為使用開放性載體可有效保存未成熟卵母細胞。目前尚缺乏人類胚胎及卵母細胞經(jīng)液氮感染病毒或其它微生物的報道，大多數(shù)中心選用冷凍效率較高的開放性載體，有Cryloop、J.Y.straw、Cryotop、Cryotip、Cryoleaf、電鏡銅網(wǎng)等［22］。對于動物研究，在詳細比較了幾種常用的冷凍載體，綜合評價后，認為使用小型開放麥管（SOPS）是較好的哺乳動物未成熟卵母細胞冷凍載體［23］。

六、未成熟卵母細胞先冷凍后培養(yǎng)還是培養(yǎng)成熟再行冷凍

有關玻璃化冷凍體外成熟培養(yǎng)的人類未成熟卵母細胞在超微結構方面影響的研究結果表明先冷凍后培養(yǎng)（vIVM）組與先培養(yǎng)后冷凍（fIVM）組相比，卵母細胞成熟率低，退化率相對高［24］。有文獻報道fIVM組可以達到與冷凍新鮮成熟卵母細胞相近的復蘇率［25］，Yazdanpanah等［26］的研究發(fā)現(xiàn)也與前者相一致。透射電鏡顯示vIVM組皮質(zhì)顆粒CGs大量地減少，同時卵母細胞胞質(zhì)內(nèi)出現(xiàn)空泡和小的線粒體滑面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)聚集物。目前普遍傾向于先體外培養(yǎng)成熟后冷凍［27］，已經(jīng)有相關臨床妊娠的報道［28］。先養(yǎng)后凍可能會損失一定量的未成熟卵母細胞，及時凍存獲取的未成熟卵母細胞有可能為患者提供更多的機會。綜合考慮，先凍后養(yǎng)仍有一定的應用研究價值。

七、是否保留卵丘顆粒細胞

卵冠丘顆粒細胞與卵母細胞間存在著廣泛的連接，對卵母細胞的成熟有重要的作用。在冷凍過程中保留顆粒細胞層是利于還是限制卵母細胞有多方研究，但仍存有爭議。理論上保留完整地卵冠丘復合物，會對冷凍速率產(chǎn)生影響，顆粒細胞可能形成一種僵硬結構在冷凍脫水過程中影響卵母細胞的形態(tài)變化。研究認為顆粒細胞是否存在對卵母細胞的冷凍效果無明顯影響［29］，但鑒于卵冠丘細胞對復蘇后未成熟卵的體外成熟的重要作用，主張對要先行體外培養(yǎng)的未成熟卵母細胞，要保留完整卵冠丘復合物。同時考慮到冷凍復蘇技術中顆粒細胞經(jīng)吹打易脫去或造成細胞損傷，有引起復蘇后的未成熟卵體外成熟阻滯的可能性，故在行冷凍復融操作時需謹慎把握每個細節(jié)。

八、未成熟卵母細胞體外成熟培養(yǎng)體系的新進展

未成熟卵母細胞體外成熟培養(yǎng)技術為未成熟卵母細胞的冷凍技術提供了技術基礎，經(jīng)過幾十年的發(fā)展，IVM 技術已取得了一定進展［30］，從理論上講，很多IVM 培養(yǎng)基已經(jīng)接近體內(nèi)環(huán)境以及提供了與自然生長相似的條件。體外培養(yǎng)時間、促成熟因子的添加濃度也更精確，新近研究在基礎培養(yǎng)基中添加抗氧化劑［31］、減數(shù)分裂抑制劑等取得了較好的實驗結果。進一步優(yōu)化IVM體系，在體外培養(yǎng)過程中盡量保持卵母細胞生理結構和功能完整性［32］，將其與未成熟卵母細胞冷凍技術聯(lián)合起來，促進核質(zhì)發(fā)育同步是繼續(xù)努力的方向［33］。

九、冷凍保護因子預處理

有學者主張使用冷凍保護因子（GSF）、抗凍蛋白等減小冷凍損傷，提高冷凍效率。Liang等［34］研究在玻璃化冷凍前使用細胞松弛素B（CB）預處理可以提高復蘇存活率，但并不增加成熟率和胚胎發(fā)育潛能。Sprícigo等［35］主張在玻璃化冷凍前添加膽固醇載體 Methyl－β－cyclodextrin（MβCD），能夠促進核成熟，減少玻璃化冷凍或應激冷刺激的損傷，同時提高卵母細胞質(zhì)膜在玻璃化冷凍中的耐受性，相關研究不多，尚需更多的數(shù)據(jù)支持。

十、冷凍保存時間

通常認為在液氮（－196℃）條件下，細胞生物活性處于停滯態(tài)，液氮中唯一的損害因素是外界物理輻射造成的DNA結構破壞。理論上未成熟卵母細胞儲存在液氮里是安全的，關于冷凍胚胎的研究認為延長冷凍保存時間并不影響胚胎質(zhì)量［36］。卵母細胞冷凍多年后復蘇，在受精率、卵裂率、胚胎質(zhì)量及發(fā)育能力、種植率和嬰兒出生率方面與新鮮卵母細胞相比無顯著差異［37］。冷凍未成熟卵母細胞的保存時間缺乏相關報道，從實用的角度達成的共識一般為3～10年。

自1998年Tucker等［38］首次報道了GV期未成熟凍融卵母細胞體外培養(yǎng)成熟后移植孕育分娩一健康女嬰以來，越來越多的生殖學家開始關注未成熟卵母細胞冷凍保存，盡管該項技術難度很大，但其應用前景廣闊，隨著基礎研究和臨床實踐的不斷推進，取得了一定成績，已有數(shù)例妊娠分娩的報道［39］，但是總體妊振率是很低的。同時在遠期安全性評估方面，IVM及冷凍技術都可能帶來損傷引發(fā)染色體異常，多精受精和孤雌生殖的可能性相對增大［40］，目前冷凍對受精后胚胎的發(fā)育潛能及胚胎著床的影響尚不確切。重視對此項技術出生的嬰兒的隨訪，加強遺傳損傷的檢測?？梢詫⑽闯墒炻涯讣毎睦鋬霰４婵闯捎衫鋬鰪吞K技術、IVM培養(yǎng)、體外受精及胚胎發(fā)育等組成的一套體系，其中涉及每項技術都有再完善的空間，特別是IVM技術與冷凍技術的結合增加了技術難度。總的來看，未成熟卵母細胞的冷凍技術面臨的挑戰(zhàn)很大［41］，需要做更多更深入的基礎與臨床的研究。隨著對卵母細胞結構，體內(nèi)成熟及發(fā)育過程的復雜調(diào)節(jié)近一步認識，IVM培養(yǎng)體系的不斷優(yōu)化以及低溫冷凍保存技術的完善發(fā)展，理想的未成熟卵母細胞冷凍方案有望達成共識，為女性生育力保存提供技術支持［42］。

［1］Gook DA.History of oocyte cryopreservation［J／OL］.Reprod Biomed Online，2011，23：281－289.

［2］Chian RC，Uzelac PS，Nargund G.In vitro maturation of human immature oocytes for fertility preservation［J］.Fertil Steril，2013，99：1173－1181.

［3］李小紅，李尚為 .配子捐贈實施的現(xiàn)狀及其相關的倫理和法律問題［J］.中國醫(yī)學倫理學，2013，26：44－46.

［4］祝彬，姜柏生 .夫妻離異時冷凍受精胚胎所有權的歸屬［J］.醫(yī)學與哲學（人文社會醫(yī)學版），2008，29：28－30.

［5］Yazdanpanah F，Khalili MA，Eftekhar M，et al.The effect of vitrification on maturation and viability capacities of immature human oocytes［J］. Arch Gynecol Obstet，2013，288：439－444.

［6］Borini A，Bianchi V.Cryopreservation of mature and immature oocytes［J］.Clin Obstet Gynecol，2008，53：763－774.

［7］Al－Khtib M，Perret A，Khoueiry R，et al.Vitrification at the germinal vesicle stage does not affect the methylation profile of H19and KCNQ1OT1imprinting centers in human oocytes subsequently matured in vitro［J］.Fertil Steril，2011，95：1955－1960.

［8］Gunasheela S，Gunasheela D，Jaykumar A，et al.Live birth after in vitro maturation and vitrification of immature oocytes retrieved from conventional IVF cycle：a case report［J］.J Assist Reprod Genet，2012，29：1073－1076

［9］章志國 .女性生育力保存方法探索：ICSI周期中未成熟卵母細胞的再利用研究［D］.合肥：安徽醫(yī)科大學，2013.

［10］Asimakopoulos B，Kotanidis L，Nikolettos N.In vitro maturation and fertilization of vitrified immature human oocytes，subsequent vitrification of produced embryos，and embryo transferafter thawing ［J］.Fertil Steril，2011，95：2123.

［11］Cao YX，Xing Q，Li L，et al.Comparison of survival and embryonic development in human oocytes cryopreserved by slow－freezing and vitrification［J］.Fertil Steril，2009，92：1306－1311.

［12］Smith GD，Serafini PC，F(xiàn)ioravanti J，et al.Prospective randomized comparison of human oocyte cryoparison of slowrate freezing or vitrification［J］.Fertil Steril，2010，94：2088－2095.

［13］Martfnez－Burgos M，Herrem L，Meglas D，et al.Vitrification versus slow freezing of oocytes effects on morphologic appearance，meiotic spindle configuration，and DNA damage［J］.Fertil Steril，2011，95：374－377.

［14］羅莉，韓曦，趙靜，等 .玻璃化冷凍與慢速程序冷凍法保存人MI期卵母細胞的效果比較［J］.陜西醫(yī)學雜志，2012，41：399－401.

［15］Combells CM，Ceyhan ST，Wang H，et al.Maturation outcomes are improved following Cryoleaf vitrification of immature human oocytes when compared to choline－based slow－freezing［J］.J Assist Reprod Genet，2011，28：1183－1192.

［16］Brambillasca F，Guglielmo MC，Coticchio G，et al.The current challenges to efficient immature oocyte cryopreservation［J］.J Assist Reprod Genet，2013，10：145－148.

［17］袁水橋，楊瑞峰，周生來，等 .冷凍平衡液及保護劑的不同組合對小鼠未成熟卵母細胞OPS法冷凍效果的影響［J］.生殖醫(yī)學雜志，2009，18：548－550.

［18］Milliken DA，Sheperd JH.Fertility preserving surgery for carcinoma od the cervix［J］.Curr Opin Oncol，2008，20：575－580.

［19］Tharasanit T，Manee－In S，Buarpung S，et al.Successful pregnancy following transfer of feline embryos derived from vitrified immature cat oocytes using＇stepwise＇cryoprotectantexposure technique［J］.Theriogenology，2011，76：1442－1449.

［20］Somfai T，Nakai M，Tanihara F，et al.Comparison of ethylene gilcol and giycol for the vitrification of immature porcine oocytes［J］.J Reprod Develop，2013，59：378－384.

［21］海蘭，譚麗，毛根紅，等 .不同冷凍載體對小鼠成熟卵母細胞玻璃化冷凍的影響［J］.鄭州大學學報（醫(yī)學版），2012，47：550－553.

［22］黃海寧，孫海翔 主編 .體外受精－胚胎移植實驗室技術［M］.北京：人民衛(wèi)生出版社，2012：276－278.

［23］Fernández－Reyez F，Ducolomb Y，Romo S，et al.Viability，maturation and embryo development in vitro of immature porcine and ovine oocytes vitrified in different devices［J］.Cryobiology，2012，64：261－266.

［24］Shahedi A，Hosseini A，Khalili MA，et al.The effect of vitrification on ultrastructure of human in vitro matured germinal vesicle oocytes［J］.Eur J Obstet Gynecol Reprod Biol，2013，167：69－75.

［25］Cao YX，Xing Q，Zhang ZG，et al.Cryopreservation of immature and in－vitro matured human oocytes by vitrification［J／OL］.Reprod Biomed Online，2009，19：369－373.

［26］Yazdanpanah F，Khalili MA，Eftekhar M.et al.The effect of vitrification on maturation and viability capacities of immature human oocytes［J］.Arch Gynecol Obstet，2013，288：439－44.

［27］Fasano G，Demeestere I，Englert Y.In－vitro maturation of human oocytes：before or after vitrication？［J］.J Assist Reprod Genet，2012，29：507－512.

［28］Ribeiro Cubal AF，F(xiàn)erreira Carvalho JI，Costa MF，et a1.Fertility－sparing surgery for early－stage cervical cancer［J／OL］.Int J Surgl Oncol，2012，7：1－11.

［29］龔斐，蔡素芬，盧光琇 .改良體外成熟培養(yǎng)——多囊卵巢綜合征患者助孕治療的有效替代方案［J］.生殖醫(yī)學雜志，2012，21：423－426.

［30］錢易，孟艷，崔毓桂，等 .卵丘細胞在卵母細胞發(fā)育過程中的作用［J］.生殖醫(yī)學雜志，2013，22：375－378.

［31］謝娟珂，韋多，宋小兵，等 .外源性褪黑素在人類未成熟卵母細胞體外成熟中的應用研究［J］.生殖醫(yī)學雜志，2013，22：828－831.

［32］宣恒華，馮定慶，趙衛(wèi)東 .體外成熟的卵母細胞胞質(zhì)成熟的評價指標［J］.生殖醫(yī)學雜志，2012，21：406－410.

［33］李梅，陳子江 .不同成熟期人卵冷凍保存研究中的爭議問題［J］.中國計劃生育和婦產(chǎn)科，2013，5：13－25.

［34］Liang Y，Rakwongrit D，Phermthai T，et al.Cryopreservation of immature buffalo oocytes：effects of cytochalasin B pretreatment on the efficiency of cryotop and solid surface vitrification methods［J］，Anim Sci J，2012，83：630－638.

［35］Sprícigo JF，Morais KS，Yang BS，et al.Effect of the exposure to methyl－β－cyclodextrin prior to chilling or vitrification on the viability of bovine immature oocytes［J］.Cryobiology，2012，65：319－325.

［36］Riggs R，Mayer J，Dowling－Lacey D，et al.Does storage time influence postthaw survival and pregnancy outcome？An analysis of 11 768cryopreserved human embryos［J］.Fertil Steril，2010，93：109－115.

［37］Parmegiani L，Garello C，Granella F，et al.Long－term cryostorage does not adversely affect the outcome of oocyte thawing cycles［J／OL］.Reprod Biomed Online，2009，19：374－379.

［38］Tucker MJ，Wright G，Morton PC，et al.Birth after cryopreservation immature oocytes with subsequent in vitro maturation［J］.Fertil Steril，1998，70：578－579.

［39］Wu J，Zhang L，Wang X.In vitro maturation，fertilization and embryo development after ultrarapid freezing of immature human oocyte［J］.Reproduction，2001，121：389－393.

［40］李娜，苗聰秀，關素萍，等 .玻璃化冷凍法在未成熟卵母細胞冷凍技術中的應用［J］.中國計劃生育學雜志，2012，20：690－692.

［41］Brendan Maher.Little consensus on egg freezing［J］.Nature，2007，449：958.

［42］劉思邈，鄧成艷 .女性化療患者的生育能力保護［J］.生殖醫(yī)學雜志，2013，22：205－209.