周文靜，馮穎，王慧紅，沈蓉蓉，徐維海

（浙江省杭州市婦產(chǎn)科醫(yī)院生殖中心，杭州 310000）

體外胚胎培養(yǎng)的各個環(huán)節(jié)均有可能發(fā)生細菌污染，現(xiàn)在用于體外受精-胚胎移植（IVF-ET）的培養(yǎng)液基本都含有抗生素，可以抑制多數(shù)細菌的生長，但耐藥菌株的存在卻仍然能夠污染胚胎培養(yǎng)體系，從而影響到胚胎發(fā)育。細菌污染對胚胎發(fā)育的影響目前尚未見文獻報道。本文觀察了小鼠卵裂期胚胎受到污染后的發(fā)育情況，并對部分受污染胚胎更換含不同抗生素的培養(yǎng)液，觀察補救措施對污染胚胎發(fā)育結局的影響，探討胚胎細菌污染的處理思路。

一、材料與方法

1.大腸桿菌菌液制備：大腸桿菌由本院細菌室分離，為慶大霉素耐藥［最低抑菌濃度（MIC 12）μg／ml］，阿米卡星敏感（MIC≤2μg／ml）菌株，采用比濁和倍比稀釋配制100cfu／ml的菌懸液備用。

2.小鼠胚胎獲取和分組：5 只7 周齡的雌性C57BL／6J小鼠腹腔注射孕馬血清（PMSG）10U／只，48h后腹腔注射人絨毛膜促性腺激素（HCG）10U／只，按雌雄比例1∶1合籠，24h后處死雌鼠取胚，剔除碎片較多和質量差的胚胎。獲取90枚2-細胞胚胎，隨機分成3組，每組30個胚胎：A 組為對照組，B組為細菌污染后未采取干預組，C 組為細菌污染1d后更換含不同抗生素的培養(yǎng)液組。

3.培養(yǎng)條件：含10%血清代用品SSS（Irvine，美國）的G-1培養(yǎng)液（Vitrolife，瑞典）制成50μl的微滴（G-1培養(yǎng)液成分中已含有慶大霉素），礦物油覆蓋，所有胚胎置于微滴中37℃、6%CO2飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

4.實驗方法：按組別在每個微滴加入10 個小鼠胚胎，每組3個微滴。在B組和C 組微滴中加入大腸桿菌懸液20μl，培養(yǎng)24h后（D1）觀察各組胚胎發(fā)育和細菌生長情況，并將C 組胚胎清洗后轉入新配制的添加了阿米卡星的G-1培養(yǎng)液中繼續(xù)培養(yǎng)，72h后（D3）再次觀察各組胚胎發(fā)育和細菌生長情況。

5.觀察指標：各組的胚胎發(fā)育、胚胎死亡、囊胚形成和細菌生長情況。鏡下觀察，將卵裂球退化、崩解的胚胎判定為死亡。囊胚的分期和質量評價根據(jù)David Gardner囊胚評分標準［1］。對微滴中培養(yǎng)液進行細菌培養(yǎng)，判定細菌生長情況。

6.統(tǒng)計學分析：相關數(shù)據(jù)采用SPSS 13.0進行分析，采用χ2檢驗，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

二、結果

1.D1觀察結果：A 組培養(yǎng)液清亮，胚胎全部存活；B組和C組培養(yǎng)液渾濁，鏡下觀察有密集的類似桿菌形態(tài)物質存在；B 組和C 組的胚胎存活率均顯著低于A 組（P 均＜0.001），B 組和C 組之間的胚胎存活率無顯著性差異（P＞0.05）。B、C 兩組的存活胚胎卵裂球數(shù)和細胞間致密程度明顯低于A 組胚胎，呈現(xiàn)發(fā)育遲滯的現(xiàn)象（表1）。

2.D3觀察結果：A 組培養(yǎng)液清亮，胚胎全部形成囊胚；B 組培養(yǎng)液渾濁，胚胎全部死亡；C 組培養(yǎng)液清亮，囊胚形成率顯著高于B 組（P＜0.001），但明顯低于A 組（P＜0.001）（表1）；A 組囊胚以IV期和V 期囊胚為主，囊胚腔均已較好的擴張，囊胚的內(nèi)細胞和滋養(yǎng)細胞數(shù)量較多，優(yōu)質囊胚較多（96.7%）（表2），C 組囊胚腔較小，部分為囊胚腔未完全擴張的II期囊胚，內(nèi)細胞和滋養(yǎng)細胞數(shù)均較少，無優(yōu)質囊胚（圖1）。細菌培養(yǎng)結果提示A 組和C組培養(yǎng)液中均無細菌生長，B 組培養(yǎng)液中證實為大腸桿菌生長。

表1 三組胚胎發(fā)育情況［n（%）］

表2 A、C兩組囊胚質量評價

圖1 體外培養(yǎng)D3胚胎形態(tài)（×200）

三、討論

細菌污染是體外胚胎培養(yǎng)中可能發(fā)生的嚴重事件，精液、卵泡液、培養(yǎng)液和環(huán)境中的細菌都有可能成為污染來源，實驗室可以通過加強無菌操作的意識、使用含有抗生素的培養(yǎng)液等方法進行預防，但在IVF過程中胚胎污染仍然有一定的發(fā)生率，朱桂金等［1］曾報道胚胎污染的發(fā)生率為0.51%，最主要的污染來源是帶菌的精液，其中大腸桿菌是引起胚胎污染的最常見的病原體之一［2-3］。

細菌污染可以對胚胎的生長和發(fā)育造成嚴重影響。細菌快速生長繁殖，消耗了培養(yǎng)液中的營養(yǎng)，釋放大量對胚胎具有毒性的代謝物。大腸桿菌等革蘭氏陰性桿菌在繁殖或死亡時還釋放內(nèi)毒素，對胚胎具有細胞毒作用［3-4］。本研究采用大腸桿菌污染小鼠2-細胞胚胎，結果顯示，胚胎受到細菌污染第1天即出現(xiàn)死亡，存活胚胎的發(fā)育也受到了嚴重的影響，出現(xiàn)了較多的低質量胚胎，不作處理繼續(xù)培養(yǎng)，胚胎則全部死亡。而對被污染胚胎進行換液處理，能顯著改善污染胚胎發(fā)育的結局，因為更換培養(yǎng)液能去除大部分的細菌，而新加入的抗生素能有效地抑制細菌生長，因此存活胚胎得以繼續(xù)發(fā)育。部分受到污染的胚胎換液雖然能夠繼續(xù)發(fā)育形成囊胚，但發(fā)育潛能仍然受到了損傷，這些囊胚的囊胚腔均較小，部分囊胚腔未完全擴張，內(nèi)細胞團小，滋養(yǎng)細胞也較少，總體囊胚質量較差。這說明雖然細菌污染已經(jīng)清除，但早期發(fā)生的細菌污染已經(jīng)對胚胎造成了損傷，有數(shù)據(jù)表明，由卵裂期質量較差胚胎發(fā)育而來的囊胚，非整倍體概率增加，種植率和妊娠率均降低［5］。

人類胚胎培養(yǎng)中污染的胚胎處理仍是一個有爭議的問題，我們通過對細菌污染的小鼠胚胎發(fā)育觀察發(fā)現(xiàn)，對于早期（D1）發(fā)現(xiàn)的細菌污染，如果及時進行換液和更換抗生素體系的處理，可以完全去除耐藥菌的污染，使部分有發(fā)育潛能的胚胎繼續(xù)發(fā)育。但是在本研究中，污染換液組得到的囊胚質量并不高，這可能是由于污染菌以及其產(chǎn)生的各種毒素和代謝的酶類對胚胎細胞的超微結構和分子水平造成了遠期的影響，沖洗和換液過程中也有可能對胚胎造成損傷，細菌污染對胚胎發(fā)育的遠期影響仍需要進一步的觀察和數(shù)據(jù)評估。對于卵巢功能較差的患者，能夠得到可供移植的胚胎的數(shù)量是有限的，如果可以對污染的胚胎進行處理，對于去除污染并發(fā)育為囊胚的胚胎進行移植，可增加病人妊娠的機會。人類胚胎培養(yǎng)中也有發(fā)生污染后經(jīng)過處理成功妊娠并分娩的報道［6-7］。但是出于對胚胎質量的擔憂和母體感染風險的考慮，目前大多數(shù)中心并不建議移植污染胚胎，因此對于發(fā)生細菌污染的IVF周期，首先要確定病原體的種類和來源，針對不同的污染來源采取相應對策。對于來自患者精液或卵泡液中的病原體，下次周期前可使用敏感抗生素取卵或取精前預防用藥，使用含有不同抗生素體系的培養(yǎng)液，如果證實細菌來源是精液的病例，可改行ICSI方式受精，避免精液中細菌接觸到卵子和培養(yǎng)體系從而杜絕污染的可能性［8］。

［1］ Gardner DK，Lane M，Stevens J，et al.Blastocyst score affects implantation and pregnancy outcome：towards a single blastocyst transfer［J］.Fertil Steril，2000，73：1155-1158.

［2］ 朱桂金，魏玉蘭，胡娟，等.體外受精過程中胚胎污染及其來源的探討［J］.中華婦產(chǎn)科雜志，2004，39：382-384.

［3］ Snyman E，VanderMerwe JV.Endotoxin-pollutedmedium in a human in vitro fertilization program［J］.Fertil Steril，1986，46：273-266.

［4］ Kastrop PM，de Graaf-Miltenburg LA，Gutknecht DR，et al.Microbial contamination of embryo cultures in anART laboratory：sources and management［J］.Hum Reprod，2007，22：2243-2248.

［5］ 魯振宇，張云山，糜若然.胚胎發(fā)育對囊胚形成的影響［J］.天津醫(yī)藥，2010，38：257-259.

［6］ 羅清炳，楊梅，王華，等.體外受精過程中胚胎污染的臨床結局分析（附精液反復污染改行ICSI妊娠一例）［J］.優(yōu)生與優(yōu)育雜志，2009，17：115-116.

［7］ 李俐琳，李穗萍，林雯青，等.人類胚胎體外培養(yǎng)細菌污染12例分析［J］.熱帶醫(yī)學雜志，2012，12：1106-1107.

［8］ Seidman DS，Madjar I，Levron J，et al.Testicular sperm aspirationandintracytoplasmic sperm injection forpersistent infection of the ejaculate［J］.Fertil Steril，1999，71：564-566.