田元祥 趙建新 徐 蕾 王奕力 孫 奇 王先敏

(中國中醫(yī)科學(xué)院中醫(yī)臨床基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所，北京 100700;新疆維吾爾自治區(qū)中醫(yī)藥研究院科研科，新疆 烏魯木齊 830000)

反復(fù)腦缺血再灌注模型(repeated cerebral ischemiareperfusion，RCIR)在造模過程中，實(shí)驗(yàn)小鼠死亡率極高。我們在長期研究過程中觀察到，對RCIR造模技術(shù)陌生的手術(shù)操作者，實(shí)驗(yàn)小鼠死亡率在60% ～80%左右，經(jīng)過規(guī)范培訓(xùn)的熟練手術(shù)操作者，實(shí)驗(yàn)小鼠死亡率在20%～40%左右。為了探討造模過程中與造模結(jié)局相關(guān)的影響因素，我們對RCIR造模過程中小鼠體質(zhì)量、操作者因素與造模結(jié)局之間的關(guān)系進(jìn)行研究，以期降低造模過程中實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的死亡率，結(jié)果如下。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與環(huán)境 取健康SPF級雄性昆明小鼠48只，其中1只未手術(shù)，47只進(jìn)行RCIR造模。適應(yīng)飼養(yǎng)7 d后，體質(zhì)量 32.5 ～37.7 g，平均(35.11 ±1.41)g。由北京市華阜康生物科技股份有限公司提供，動(dòng)物合格證號:SCXK(京)2009－0007。實(shí)驗(yàn)在北京華大蛋白質(zhì)研發(fā)中心有限公司清潔級動(dòng)物室進(jìn)行，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物室許可證號:SYXK(京)2013－0034。

1.2 造模與記錄方法 取47只雄性昆明小鼠，造模采用文獻(xiàn)［1］成熟方法，第1次缺血20 min后，松開夾閉的血管再灌注10 min，再次缺血20 min。在適應(yīng)飼養(yǎng)時(shí)對每只小鼠進(jìn)行編號，記錄每只小鼠體質(zhì)量。在造模過程中始終標(biāo)明小鼠編號進(jìn)行跟蹤，直至該鼠出現(xiàn)造模結(jié)局(成活或死亡)，2位操作員的造模成活情況分別記錄。為了方便描述，對結(jié)局進(jìn)行定義。造模結(jié)局A:是指在第1次缺血時(shí)死亡;造模結(jié)局B:是指在第2次缺血時(shí)死亡;造模結(jié)局C:是指在手術(shù)第2 d死亡;造模結(jié)局D:指存活;造模結(jié)局E:是指造模結(jié)局A、B、C的總和。2位操作員年資相仿，并經(jīng)過同期規(guī)范培訓(xùn)，分別記為操作員X和操作員W，操作員X造模25只，操作員W造模22只。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用SPSS 11.5軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，根據(jù)數(shù)據(jù)情況分別采用單因素方差分析、卡方檢驗(yàn)、t檢驗(yàn)及二分類Logistic回歸分析法。

2 結(jié)果

2.1 小鼠體質(zhì)量對4種造模結(jié)局的影響 見表1。

表1 小鼠體質(zhì)量對4種造模結(jié)局的影響 ±s

表1 小鼠體質(zhì)量對4種造模結(jié)局的影響 ±s

n 體質(zhì)量(g) F值 P值造模結(jié)局A 10 35.16 ±1.73造模結(jié)局 B 9 35.09 ±1.17 0.006 3 0.999 3造模結(jié)局 C 3 35.17 ±0.21造模結(jié)局D 25 35.10 ±1.49

表1數(shù)據(jù)采用單因素方差分析法分析，4種造模結(jié)局的小鼠體質(zhì)量無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(F=0.006 3，P=0.999 3)。

2.2 小鼠體質(zhì)量對2種造模結(jié)局的影響 造模結(jié)局A、B、C都是小鼠死亡，只是發(fā)生的階段不同，為了消除這3種階段對結(jié)果可能出現(xiàn)的影響，將造模結(jié)局A、B、C合并，即造模結(jié)局E。采用t檢驗(yàn)方法對結(jié)果進(jìn)行分析，結(jié)果見表2。

表2 小鼠體質(zhì)量對2種造模結(jié)局的影響 ±s

表2 小鼠體質(zhì)量對2種造模結(jié)局的影響 ±s

n 體質(zhì)量(g)t P造模結(jié)局 E 22 35.13 ±1.35－0.076 5 0.939 4造模結(jié)局D 25 35.10 ±1.49

由表2可見，2種造模結(jié)局小鼠體質(zhì)量比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=－0.076 5，P=0.939 4)。

2.3 2位操作員小鼠造模結(jié)局比較 造模結(jié)局A、B、C、D中，C只有3例，其中操作員W 1例，操作員X 2例，例數(shù)太少，不符合統(tǒng)計(jì)學(xué)檢驗(yàn)方法的要求，因此將造模結(jié)局B、C合并為B+C計(jì)算，采用卡方檢驗(yàn)對結(jié)果進(jìn)行分析，結(jié)果見表3。

表3 2個(gè)操作員小鼠造模結(jié)局比較 只

由表3可見，2個(gè)操作員之間小鼠造模結(jié)局未見統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(χ2=2.796，P=0.247 1)。

2.4 2位操作員3種造模結(jié)局小鼠體質(zhì)量比較 基于造模結(jié)局小鼠體質(zhì)量，采用t檢驗(yàn)對結(jié)果進(jìn)行分析，結(jié)果見表4。

表4 2位操作員3種造模結(jié)局小鼠體質(zhì)量比較

由表4可見，3種結(jié)局小鼠體質(zhì)量在2個(gè)操作員之間均未見統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(均P＞0.05)。

2.5 2位操作員2種造模結(jié)局小鼠比較 表3、4是基于A、B+C、D 3種造模結(jié)局分類進(jìn)行的統(tǒng)計(jì)分析，是否分類過多會(huì)對結(jié)果有明顯影響。因此，將造模結(jié)局合并成2種:造模結(jié)局E和D。D是所有存活的小鼠，E是所有死亡的小鼠。采用χ2檢驗(yàn)對基于小鼠數(shù)的結(jié)果進(jìn)行分析，結(jié)果見表5。

表5 2位操作員2種造模結(jié)局小鼠比較 只

由表5可見，2個(gè)操作員之間造模小鼠成活率無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(χ2=0.997，P=0.318 0)。

2.6 2位操作員2種結(jié)局小鼠體質(zhì)量比較 在表5基礎(chǔ)上，又基于2種造模結(jié)局小鼠體質(zhì)量，采用t檢驗(yàn)對結(jié)果進(jìn)行分析，結(jié)果見表6。

由表6可見，2種結(jié)局小鼠的體質(zhì)量在2位操作員之間均未見統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＞0.05)。

表6 2位操作員2種結(jié)局小鼠體質(zhì)量比較 ±s

表6 2位操作員2種結(jié)局小鼠體質(zhì)量比較 ±s

造模結(jié)局n E體質(zhì)量(g) n D體質(zhì)量(g)操作員X 10 34.84 ±1.49 15 34.85 ±1.62操作員 W 12 35.38 ±1.22 20 35.47 ±1.25 t 0.908 4 1.070 7 P 0.376 0 0.295 7

2.7 2位操作員和體質(zhì)量對小鼠造模結(jié)局的影響 進(jìn)行二分類Logistic回歸分析，以造模結(jié)局E、D為因變量，以體質(zhì)量和操作員為自變量，檢驗(yàn)水準(zhǔn)α設(shè)為0.05，分析2個(gè)操作員和體質(zhì)量對小鼠造模結(jié)局的影響，結(jié)果見表7。

表7 2種結(jié)局小鼠二分類Logistic回歸分析

由表7可見，操作員及體質(zhì)量與造模結(jié)局無明顯影響(P＞0.05)。

3 討論

3.1 在一定范圍內(nèi)，小鼠體質(zhì)量對造模結(jié)局無影響 文獻(xiàn)研究發(fā)現(xiàn)，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的體質(zhì)量對造模結(jié)局有一定的影響［2－3］。如趙洪云等［2］在大鼠心肌梗死模型制作中發(fā)現(xiàn)，大鼠的體質(zhì)量過小，實(shí)驗(yàn)器官也小，手術(shù)操作難度大，對手術(shù)創(chuàng)傷的耐受性差;體質(zhì)量過大，術(shù)后死亡率明顯增高。甄毅嵐等［3］研究發(fā)現(xiàn)，體質(zhì)量小，＜20 g的小鼠頸部血管易分離，操作簡單，但體質(zhì)差，成活率低;體質(zhì)量大，＞30 g的小鼠，頸部脂肪較多，實(shí)驗(yàn)中分離血管的難度加大，容易造成血管破裂，影響造模的成功率。本研究采用體質(zhì)量在32.5～37.7 g之間的小鼠研究表明，體質(zhì)量對實(shí)驗(yàn)動(dòng)物造模結(jié)局未見明顯影響(P＞0.05)，與文獻(xiàn)結(jié)果相反。可能與甄毅嵐等［3］采用的小鼠體質(zhì)量在20～39 g較寬范圍不同，即本實(shí)驗(yàn)結(jié)果能夠說明小鼠體質(zhì)量在32.5～37.7 g之間，體質(zhì)量對造模結(jié)局沒有影響，其他體質(zhì)量范圍的影響有待于以后研究。

3.2 對造模結(jié)局無影響的體質(zhì)量差可以擴(kuò)大到5.2 g 選擇什么范圍體質(zhì)量的小鼠對造模結(jié)局影響小，以往的實(shí)驗(yàn)中一般掌握為5 g，但沒有研究數(shù)據(jù)作為佐證，文獻(xiàn)的認(rèn)識也不一致［4－5］。王芙蓉等［4］根據(jù)經(jīng)驗(yàn)認(rèn)為，小鼠的體質(zhì)量差別不超過7 g，對梗死體積就沒有顯著的影響。但這是經(jīng)驗(yàn)認(rèn)為，沒有實(shí)驗(yàn)研究的科學(xué)依據(jù)。甄毅嵐等［3］將4 g作為一個(gè)分組的區(qū)間，也未對4 g是否對研究結(jié)果有影響做研究數(shù)據(jù)分析。本實(shí)驗(yàn)采用單一性別的雄性小鼠，體質(zhì)量最小為 32.5 g，最大為 37.7 g，跨度為 5.2 g，并提供了具體的研究數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，結(jié)果在這個(gè)體質(zhì)量范圍內(nèi)，體質(zhì)量對造模結(jié)局沒有影響。所以，能有科學(xué)根據(jù)地說，對造模結(jié)局無影響的體質(zhì)量差可以擴(kuò)展到5.2 g。

3.3 年資相仿并經(jīng)過同期規(guī)范培訓(xùn)的操作員對造模結(jié)局無影響 為了規(guī)范化實(shí)驗(yàn)研究的操作，本實(shí)驗(yàn)選取了未接觸過本實(shí)驗(yàn)造模流程的2位操作員，同期進(jìn)行規(guī)范化實(shí)驗(yàn)方法培訓(xùn)，并進(jìn)行了2批次50只小鼠的預(yù)實(shí)驗(yàn)，然后投入本次正式實(shí)驗(yàn)中。在相同的時(shí)間和環(huán)境中，使用相同的實(shí)驗(yàn)器械，結(jié)果表明經(jīng)過同期規(guī)范培訓(xùn)年資相仿的實(shí)驗(yàn)員對造模結(jié)局無影響(P＞0.05)。結(jié)果提示，實(shí)驗(yàn)前規(guī)范化的培訓(xùn)和一定數(shù)量的預(yù)實(shí)驗(yàn)，操作人員的實(shí)驗(yàn)水平便可以達(dá)到實(shí)驗(yàn)要求。

［1］ 趙建新，田元祥，李國明，等.擬血管性癡呆小鼠模型皮層及海馬細(xì)胞病理組織學(xué)動(dòng)態(tài)觀察［J］.中國病理生理雜志，2000，16(11):1214－1216.

［2］ 趙洪云，管慧紅，鐘雪云，等.開胸冠狀動(dòng)脈結(jié)扎法制作大鼠心肌梗死模型［J］.國外醫(yī)學(xué):內(nèi)科學(xué)分冊，2005，32(12):540－542.

［3］ 甄毅嵐，王亞男，李晟，等.線栓法制備不同體重KM小鼠局灶性腦缺血/再灌注模型的建立及評價(jià)［J］.中國實(shí)驗(yàn)動(dòng)物學(xué)報(bào)，2013，21(2):39－44，插5.

［4］ 王芙蓉，姜永生，肖文伍，等.頸內(nèi)動(dòng)脈線栓法建立小鼠局灶性腦缺血再灌注模型［J］.卒中與神經(jīng)疾病，2003，10(2):112－114.