徐 霖,冉雪琴,王嘉福

(1.貴陽(yáng)學(xué)院生物與環(huán)境工程學(xué)院, 貴州 貴陽(yáng) 550005； 2.貴州大學(xué)動(dòng)物科學(xué)學(xué)院, 貴州 貴陽(yáng) 550025； 3.貴州大學(xué)農(nóng)業(yè)生物工程省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， 貴州 貴陽(yáng) 550025)

印楝素殺蟲活性具有廣譜、高效、低毒、易降解、無(wú)殘留、無(wú)抗藥性等優(yōu)點(diǎn)，且對(duì)脊椎動(dòng)物無(wú)危害,是目前最具開發(fā)潛力的植物源農(nóng)藥.但其作用機(jī)理復(fù)雜，作用機(jī)制還未清楚，分子機(jī)制研究尚處于起步階段.有研究提示，細(xì)胞骨架肌動(dòng)蛋白是印楝素作用的假想靶標(biāo)蛋白[1]，主要是因?yàn)橛￠刈饔糜诶ハx有2個(gè)最重要的特點(diǎn)：一是昆蟲細(xì)胞較哺乳動(dòng)物細(xì)胞對(duì)印楝素敏感[2]，提示印楝素作用的靶蛋白是一種普遍存在但構(gòu)象不同或者在2種細(xì)胞中差異表達(dá)的蛋白，有研究發(fā)現(xiàn),雖然結(jié)合的氨基酸序列相似但結(jié)合后結(jié)構(gòu)完全不同，因此雖然序列幾乎沒(méi)有不同，但印楝素被藏在了哺乳動(dòng)物細(xì)胞的β-肌動(dòng)蛋白口袋里而不能起作用.二是印楝素作用范圍廣，作用方式多變，提示印楝素作用蛋白廣泛存在，細(xì)胞骨架肌動(dòng)蛋白存在于一切真核細(xì)胞胞質(zhì)空間中,由蛋白質(zhì)纖維組成的高度動(dòng)態(tài)的三維結(jié)構(gòu)的網(wǎng)架，而且在細(xì)胞內(nèi)廣泛分布于細(xì)胞質(zhì)及細(xì)胞核.細(xì)胞骨架肌動(dòng)蛋白是否是印楝素作用的靶標(biāo)分子還需要大量的驗(yàn)證性試驗(yàn).本研究運(yùn)用基因芯片技術(shù)結(jié)合Western蛋白檢測(cè)技術(shù)，進(jìn)一步研究印楝素作用的分子靶標(biāo)，為印楝素農(nóng)藥的開發(fā)提供理論依據(jù).

1 材料與方法

1.1材料

印楝素A標(biāo)準(zhǔn)品(純度 95%，100 μg·mL-1),Sigma公司產(chǎn)品；果蠅S2細(xì)胞(購(gòu)于武漢大學(xué)細(xì)胞典藏中心).

1.2試劑

胎牛血清(杭州四季青)；Schneider昆蟲細(xì)胞培養(yǎng)基粉劑(武漢創(chuàng)新生物)；MTT試劑盒(南京凱基)；二甲基亞砜(Amresco公司)；蛋白裂解液(ShineGene)； PVDF膜(Millipore公司)；一抗Mouse Anti-βactin (GenScript )；預(yù)染蛋白marker (Fermentas)；HRP二抗(GenScript)；內(nèi)參一抗Goat Anti-GAPDH (GenScript)；其他普通化學(xué)試劑(上?；瘜W(xué)試劑廠分析級(jí)試劑).

1.3主要儀器

二氧化碳培養(yǎng)箱 (上海博訊實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠)；倒置顯微鏡 (南京江南光電股份有限公司)； 超凈工作臺(tái)(蘇州凈化設(shè)備有限公司)；連續(xù)波長(zhǎng)分光光度計(jì) (美國(guó)Bio-Rad)；96孔板、酶標(biāo)板、玻璃勻漿器(寧波新芝DY89-1)；高速離心機(jī)(湖南湘儀H1650-W)；垂直板電泳轉(zhuǎn)移裝置(上海天能)；電泳儀(北京君意JY300C)；多用脫色搖床(蘇州捷美SYC-2101).

1.4細(xì)胞培養(yǎng)

果蠅S2細(xì)胞于25～28 ℃條件下培養(yǎng)(無(wú)需CO2)；過(guò)濾除菌細(xì)胞培養(yǎng)液原液在使用前添加10%滅活胎牛血清，3 d傳代1次.

1.5細(xì)胞增殖檢測(cè)[3]

取果蠅S2細(xì)胞，細(xì)胞計(jì)數(shù)器計(jì)數(shù)，保證細(xì)胞質(zhì)量濃度為 4×104個(gè)·孔-1,接種于96孔培養(yǎng)板,每孔180 μL.邊緣孔設(shè)立為不加細(xì)胞只加培養(yǎng)液的空白對(duì)照孔, 并設(shè)立陰性對(duì)照組(有細(xì)胞但不加藥物)，置入細(xì)胞培養(yǎng)箱,培養(yǎng) 24 h待細(xì)胞進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，加入不同質(zhì)量濃度印楝素使終質(zhì)量濃度分別為0.01，0.1，0.5，1.0，2.0 mg·L-1培養(yǎng)，每個(gè)處理設(shè)3個(gè)重復(fù)，分別于24，48，72，96 h，每孔加入 MTT ( 5g·L-1)溶液20 μL,繼續(xù)培養(yǎng) 4 h后中止培養(yǎng) ,離心去上清,加入 150 μL二甲基亞砜溶液 ,室溫下振蕩器振蕩 10 min,自動(dòng)酶標(biāo)儀比色 (波長(zhǎng) 490 nm).測(cè)定吸光值 (A)，并計(jì)算細(xì)胞存活率和細(xì)胞抑制率.

1.6基因芯片檢測(cè)

經(jīng)印楝素處理細(xì)胞及總RNA交由Affymetrix公司進(jìn)行基因芯片檢測(cè)，分別選擇Affymetrix公司的Gene-Chip Drosophila?Genome 2.0 Array，包含18 500 條果蠅(Drosophila melanogaster)的基因.

1.7western蛋白檢測(cè)

按常規(guī)方法完成SDS-PAGE和電轉(zhuǎn)膜操作，封閉液封閉.一抗溫育1.5 h，TBST清洗3次，每次5 min，HRP二抗溫育1.5 h，TBST清洗4次，每次5 min.經(jīng)發(fā)光、顯影、定影，拍照.

1.8數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果與分析

2.1印楝素處理果蠅的細(xì)胞形態(tài)變化

在光學(xué)顯微鏡下，果蠅S2細(xì)胞在培養(yǎng)瓶中呈半粘附狀態(tài)，細(xì)胞均勻分布，細(xì)胞透明，邊緣清晰，梭形細(xì)胞多.當(dāng)用印楝素處理細(xì)胞24 h后，細(xì)胞與瓶壁之間的粘附松散，分布開始不均勻，梭形細(xì)胞少見，個(gè)別細(xì)胞體積肥大，細(xì)胞之間的聯(lián)系松散，一些細(xì)胞邊緣不清楚并開始皺縮，細(xì)胞透明度降低;當(dāng)印楝素處理32 h后，空白組細(xì)胞梭形細(xì)胞繼續(xù)增多，但藥物處理組細(xì)胞幾乎無(wú)梭形細(xì)胞，中期細(xì)胞明顯增多.表明印楝素作用后，細(xì)胞分裂活動(dòng)較弱，大部分細(xì)胞停留在分裂中期之前(圖1) .

2.2印楝素處理果蠅細(xì)胞增殖檢測(cè)

參考相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道[3]，并結(jié)合本研究小組試驗(yàn)[4]，選用0.5 mg·L-1質(zhì)量濃度印楝素對(duì)處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的果蠅S2細(xì)胞進(jìn)行處理，并每24 h檢測(cè)毒理作用，各時(shí)間段細(xì)胞存活率及抑制率統(tǒng)計(jì)如表1所示.

圖1 印楝素(0.5 mg·L-1)處理前后果蠅S2細(xì)胞圖

表1存活率、抑制率統(tǒng)計(jì)

Table1Thestatisticofinhibitoryandsurvivalrate

組別Group時(shí)間/hTime吸光度A值A(chǔ)bsorbancevalue存活率/%Survival抑制率/%Inhibitionrate對(duì)照組Controlgoup00．3277±0．14571000試驗(yàn)組Experimentalgroup240．2093±0．00166436480．1517±0．00734654720．1885±0．01205743960．1261±0．00233862

2.3果蠅基因芯片檢測(cè)

0.5 mg·L-1印楝素處理24 h并收集細(xì)胞進(jìn)行基因芯片檢測(cè)，檢測(cè)到細(xì)胞骨架肌動(dòng)蛋白以及細(xì)胞骨架肌動(dòng)蛋白相關(guān)蛋白因子Act57B，Act42A，Arp14D，Arp53D，Actr13E，Act5C，Act87E均表達(dá)下調(diào)；而調(diào)控蛋白因子TSR，CNC均表達(dá)上調(diào)(表2).

表2 差異表達(dá)的細(xì)胞骨架肌動(dòng)蛋白、相關(guān)蛋白及調(diào)控蛋白因子

2.4Western蛋白檢測(cè)

0.5 mg·mL-1印楝素處理24，32 h并收集細(xì)胞，以GAPDH為內(nèi)參，對(duì)Actin蛋白進(jìn)行Western檢測(cè).檢測(cè)到藥物處理24 h后，印楝素處理組的β-actin表達(dá)量為對(duì)照組的93.42%；藥物處理32 h后，處理組的β-actin為對(duì)照組的91.46%.藥物處理后，Actin蛋白表達(dá)有較顯著下調(diào)(如表3,圖2).

表3 藥物處理24 h及32 h actin蛋白檢測(cè)結(jié)果

圖2 SDS-PAGE膠電泳圖譜

3 結(jié)論及討論

有報(bào)道認(rèn)為，印楝素A調(diào)節(jié)昆蟲生長(zhǎng)發(fā)育可能是通過(guò)調(diào)節(jié)神經(jīng)蛋白/肽的釋放而引起蛻皮的暫時(shí)延遲或抑制蛻皮作用[5]，但放射標(biāo)記試驗(yàn)表明,印楝素不能突破血腦屏障,但可積累分布在腦神經(jīng)分泌系統(tǒng)纖維的周緣,對(duì)其合成或釋放腦神經(jīng)分泌顆粒具抑制作用.有報(bào)道認(rèn)為，印楝素A在體外能抑制β-微管蛋白的聚合[6]，但ANURADHA等[1]通過(guò)其他試驗(yàn)證實(shí)該結(jié)論存在局限性,并且印楝素作用于細(xì)胞肌動(dòng)蛋白β-actin的效果要比作用于微管蛋白要明顯.進(jìn)一步還發(fā)現(xiàn)CycE，Cdc25等細(xì)胞周期蛋白和調(diào)控因子的過(guò)度表達(dá)可以修復(fù)印楝素誘導(dǎo)的表型異常和減少印楝素A所致的果蠅死亡.這說(shuō)明印楝素A主要作用于細(xì)胞骨架肌動(dòng)蛋白，引起果蠅發(fā)育異常和細(xì)胞凋亡等細(xì)胞缺陷.PRAVIN KUMAR等[7]也報(bào)道印楝素能夠直接作用于細(xì)胞肌動(dòng)蛋白,使肌動(dòng)蛋白發(fā)生解聚,并且作用位點(diǎn)與細(xì)胞松弛素很接近.

細(xì)胞骨架肌動(dòng)蛋白在許多細(xì)胞生命活動(dòng)中扮演著非常重要的角色，包括在細(xì)胞遷移、決定細(xì)胞形狀以及物質(zhì)運(yùn)輸?shù)?除了以上功能，肌動(dòng)蛋白還參與基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控：(1)參與核RNA運(yùn)輸、加工[8～9]；(2)參與染色質(zhì)集縮構(gòu)建染色體的過(guò)程[10]; (3)細(xì)胞核肌動(dòng)蛋白與染色質(zhì)結(jié)構(gòu)調(diào)整[11]; (4)在基因轉(zhuǎn)錄活動(dòng)中亦有作用[12～13].通過(guò)基因芯片技術(shù)檢測(cè)到Actin蛋白及其相關(guān)蛋白因子均表達(dá)下調(diào)，如actin 57B, actin 42A, actin5C, actin87E, actin-related13E,actin-related protein14E, actin-related protein 53D等，它們下調(diào)倍數(shù)不高，但無(wú)一例外表達(dá)下調(diào)；另外，也檢測(cè)到beta-Spec(beta-Spectrin)，shot(kakapo)，fwd(four wheel drive)分別上調(diào)1.54478，1.81449，1.6119，它們負(fù)調(diào)控微管的聚合或解聚，調(diào)節(jié)細(xì)胞骨架微管組裝；cnc(cap and collar) 主要功能是細(xì)胞骨架微管的極性建立及保持，上調(diào)2.12108.肌動(dòng)蛋白的這些特征及檢測(cè)到的肌動(dòng)蛋白及肌動(dòng)蛋白相關(guān)蛋白的因子均表達(dá)下調(diào)進(jìn)一步從分子學(xué)角度論證了肌動(dòng)蛋白極有可能是印楝素的靶標(biāo)蛋白.

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