王 亮，張建富，劉海珠

(威海市立醫(yī)院，山東威海264200)

凝血酶是一種血清絲氨酸蛋白酶，主要產生于高血壓腦出血、顱內動脈瘤、動靜脈畸形(AVM)破裂出血、顱腦外傷等患者的腦組織中。腦出血為神經外科常見病，但目前尚無有效治療方法。多項研究已證實，凝血酶在腦出血后神經損害和腦水腫的發(fā)生機制中扮演重要角色?，F將凝血酶在腦出血中的作用研究現狀綜述如下。

1 凝血酶的結構、生物學特性及來源

1.1 凝血酶的組成及結構 人體凝血酶由259個氨基酸殘基的重鏈B和49個氨基酸殘基的輕鏈A構成，其中重鏈B具有三個功能結構區(qū)和酶活性位點，構成凝血酶的三個功能結構區(qū):一是精氨酸側鏈口袋，其催化位點由Asp-102、His-47和Set-195構成;二是非極性結合位點，可與底物發(fā)生疏水作用;三是陰離子結合位點，可能由重鏈B的6個賴氨酸組成，主要與凝血酶調解蛋白、血小板受體等相互作用、相互識別［1］。

1.2 凝血酶的生物學特性 凝血酶多產生于局部受損的血管，能將無活性的纖維蛋白原變?yōu)橛谢钚缘睦w維蛋白，并引發(fā)諸多受體介導的過程，如平滑肌收縮、血栓素形成及血小板聚集分泌［2］;還能與內皮細胞相互作用，促進內皮源性松弛因子、前列腺素、內皮素等物質釋放。凝血酶的凝血原理為首先通過始動因子(血級聯反應)激活Ⅹa因子，將無活性的凝血酶原激活成具有活性的凝血酶，其后介導Ⅷa因子轉化成Ⅺ、Ⅶ、Ⅴ、Ⅷ的負反饋激活及纖維蛋白原轉變成纖維蛋白的過程，進而激活血小板。

1.3 凝血酶的產生途徑 凝血酶原是一種主要由人體肝臟合成、以微分子水平存在于血漿中的物質。Ⅴa凝血因子可以借助外源性或者內源性凝血途徑產生，并將凝血酶原轉化成凝血酶。由于1 mL全血能形成1.5 nmol凝血酶，發(fā)生腦損傷或腦出血的患者會出現實質性腦損害，繼而導致凝血酶原發(fā)生裂解產生大量的凝血酶。因此，凝血酶既可來自腦組織自身，也可以產生于局部損傷部位。體外相關研究［3］證實，凝血酶原mRNA可在腦膠質源性和組織神經元的細胞系中表達，腦部有缺血損害者腦凝血酶原mRNA表達也會有所上調，提示在腦中存在ⅩamRNA的情況下，即使血腦屏障(BBB)未遭到破壞，凝血酶依然能形成和導致腦損害。但以上作用反應的機制尚不清楚。

1.4 凝血酶與凝血酶受體(TR) 凝血酶主要通過與TR結合發(fā)揮作用。TR是蛋白酶激活受體，由包括胞內環(huán)狀結構(3個)和胞外環(huán)狀結構(3個)等在內的7個疏水跨膜區(qū)域構成，其末端氨基延伸到了細胞外，其中有與凝血酶陰離子結合位點相結合的序列LDPR/SFLL和識別凝血酶的序列KYEPFWEDEE。以上兩個結構相互作用可使TR的第41位和42位氨基酸發(fā)生裂解，形成新的氨基末端(起始序列為SFLLRN)。在神經系統中，凝血酶可與暴露受體外功能區(qū)的配基序列及自身的配基袋相互作用，促進細胞活化、引起其他相關變化［4，5］。

2 凝血酶在腦出血后病變發(fā)生中的作用

2.1 腦組織毒性 Lee等［6］運用立體定向注入的方法，分別向大鼠右側基底節(jié)注入濃縮血細胞、血清、血漿、全血，24 h后處死動物并測量其腦內離子含量及水腫程度，結果發(fā)現全血組的離子含量未改變、腦水腫量與腦含水量增加值一致。提示腦水腫的發(fā)生和血漿、血清及濃縮血細胞無必然關系，血漿中加入一定量的凝血酶原也可引發(fā)腦水腫。另有研究［7］顯示，將凝血酶抑制劑alpha-NAPAP注入到凝固血塊中能明顯減輕腦內血腫腫塊邊緣水腫，但無法改變血腫的原有容積。表明凝血酶的化學刺激作用大于血凝塊的機械壓迫作用。Xi等［8］發(fā)現，大鼠腦出血后腦水腫未達高峰前，右側基底節(jié)注入凝血酶后24～48 h腦水腫達到高峰;而注入濃縮紅細胞后2 d內亦無明顯腦水腫跡象，但3 d后腦組織含水量明顯增加。提示凝血酶在早期腦水腫發(fā)生中起作用，而紅細胞則在晚期腦水腫發(fā)生中起作用，二者起效時間不同。凝血酶的神經毒性作用主要體現在以下幾個方面:①注入基底節(jié)區(qū)后可引起腦水腫;②血凝塊中凝血酶原轉化成凝血酶的數量隨腦水腫程度加強而逐漸增加;③特異性凝血酶抑制劑對腦出血后腦水腫形成有抑制和減弱作用。實驗表明，凝血酶濃度為l U/mL時可增加腦組織水含量，10 U/mL時會明顯增加患者病死率。另有研究［9］表明，脊髓和腦組織中存在很多凝血酶結合位點，凝血酶濃度在50 pmol/L～50 nmol/L時可有效保護腦細胞，＞50 nmol/L時則會損傷腦細胞;對于腦內血腫，用小劑量凝血酶進行預處理可縮小缺血范圍［10］，保護腦細胞、減小腦血腫體積［11］。同時，小劑量凝血酶還能激活神經細胞及神經膠質細胞上的TR、阻止細胞凋亡。

2.2 引發(fā)腦水腫 凝血酶引發(fā)腦水腫的途徑包括血管源性和細胞毒性兩種，前者主要發(fā)生在腦出血24 h后，因正常生理狀態(tài)下BBB阻止了部分大分子物質通過血管壁進入腦組織，一旦血管的通透性增強，血漿成分會經由血管壁滲出，進入到腦組織間隙后引發(fā)血管源性腦水腫［12］;后者主要發(fā)生于腦出血后24 h內，由凝血酶破壞BBB所致。凝血酶特異性抑制劑水蛭素能明顯減輕腦水腫程度。研究表明，通過肝素化保持自體血液不凝固引發(fā)的腦水腫與其他性質腦水腫不同，表現為24 h內血腫周圍未出現水腫。血細胞膜上磷脂的實際釋放速度可能會控制凝血酶原轉化為凝血酶的進程，并控制凝血酶的實際釋放速度，整個控制過程達數小時，即血細胞破壞的速度會直接影響凝血酶產生速度。因此，腦部受損后的第一個24 h內，腦細胞破壞率增加促進產生更多的凝血酶、引起磷脂聚集增加，從而加重腦水腫;而腦水腫和腦細胞死亡是因為大劑量凝血酶(＞5 U)破壞BBB引起，提示凝血酶是一種神經毒性介質［13］。水通道蛋白4(AQP-4)是腦組織中分布最廣、含量最多的水通道蛋白。凝血酶可上調AQP-4表達，進而增加水分子快速跨膜轉運，從而加重腦水腫;向腦內注射一定量凝血酶可增加注射點周圍組織AQP-4表達，且其表達變化與腦組織含水率變化一致［14］。

2.3 破壞BBB Lee等［6］發(fā)現，在大鼠基底節(jié)區(qū)注射凝血酶后3H標記的α-氨基異丁酸表達升高，認為凝血酶可破壞BBB、引發(fā)腦細胞死亡，但通常不影響腦血流。因此，腦水腫形成的誘因為BBB破壞和凝血酶的神經毒性作用;凝血酶還可劑量依賴性增加血管內皮細胞層通透性。Nagy等發(fā)現，在體外培養(yǎng)液中加入凝血酶后人腦微血管內皮細胞立即收縮、細胞間隙擴大，去除凝血酶后半小時細胞恢復正常形態(tài)，認為上述變化是凝血酶改變了BBB的通透性所致;早期腦水腫可由細胞毒性引發(fā)，后期則是由BBB遭到破壞所致?；|金屬蛋白酶(MMP)能分解細胞外基質、破壞腦細胞的基底膜，從而破壞BBB的完整性;對于高血壓腦出血患者，凝血酶可能通過激活血管內皮細胞和巨噬細胞，使MMP-9、MMP-2表達增加，進而損壞BBB的完整性［15］。

2.4 腦血管毒性 腦血管容易受到凝血酶的雙重作用。低濃度凝血酶的內皮依賴性和快速減敏作用可引起血管擴張，可能機制為內皮細胞受刺激后產生內皮源性舒張因子［16］，激活血管平滑肌細胞中鳥苷酸環(huán)化酶，使cGMP濃度升高、平滑肌松弛;高濃度凝血酶則可使血管發(fā)生持久而緩慢的收縮，細胞外鈣離子濃度變化可能與此有關。高血壓患者發(fā)生腦出血后，血腫周圍腦組織的血流短暫下降，且血流速度與腫塊大小有關;腦缺血的程度與時間決定高血壓腦出血后腦梗塞程度;猴類腦組織血流下降至10～12 mL/(100 g·min)數小時后才會慢慢出現腦梗塞，血流長時間維持在25 mL/(100 g·min)時則不會出現腦梗塞。因此，人腦出血后局部腦血流下降可能與凝血酶無明顯相關。

3 抗凝血酶治療在腦出血中的應用

3.1 內源性凝血酶抑制劑 抗凝血酶治療對腦出血預后有積極意義，內源性凝血酶抑制劑主要包括纖溶酶原激活物抑制劑1和蛋白酶連接素1等。其中蛋白酶連接素1為腦內所特有的高效凝血酶抑制劑，主要由腦內膠質細胞分泌，可與凝血酶形成復合物后結合于膠質細胞表面。纖溶酶原激活物抑制劑1主要由內皮細胞分泌，在腦組織內廣泛表達，能快速、高效抑制纖溶酶原激活物及尿激酶，其在高血壓腦出血后患者體內的水平變化與凝血酶有關［17］，且可通過拮抗凝血酶的毒性作用保護腦組織。研究［18］發(fā)現，大腦中動脈阻塞患者纖溶酶原激活物抑制劑1水平顯著降低，可用于指導溶栓藥物的安全應用。

3.2 外源性凝血酶抑制劑 主要包括alpha-NAPAP(人工合成)、水蛭中提取的水蛭素和肝素等。肝素抑制凝血酶的機制有三種:一是與凝血因子Ⅲ結合形成復合物，抑制凝血酶及其他凝血因子;二是與陰離子結合位點和凝血酶的催化位點結合;三是可能增強腦內纖溶酶原激活物抑制劑1和蛋白酶連接素1的作用。水蛭素是從天然水蛭中提取的、目前作用最強的凝血酶特異性抑制劑，可通過非共價鍵與凝血酶的催化位點及陰離子外位點結合。目前，人們已經合成了多種凝血酶的抑制劑。

綜上所述，凝血酶在腦出血后腦水腫等病變發(fā)生中具有一定作用，但其毒性作用的分子機制尚不明確;抗凝血酶治療可能是防治腦出血后繼發(fā)性腦損傷的有效措施之一。

［1］Di Cera E，Cantwell AM.Determinants of thrombin specificity［J］.Ann N Y Acad Sci，2001，936(1):133-146.

［2］Silva Y，Leira R，Tejada J，et al.Molecular signatures of vascular injury are assaciated with early growth of intracerebral hemorrhage molecular signatures of vascular injury are associated with early growth of intracerebral hemorrhage［J］.Stroke，2005，36(1):86.

［3］Reymann KG.Increase of prothrombin-mRNA after global ischemia in rats，with constant expression of protease nexin-1 and proteaseactivated reception［J］.Neurosci Lett，2002，329(2):181-184.

［4］Gabazza EC，TaguchiO，Kamada H，etal.Progress in the understanding of protease-activated receptors［J］.Int JHematol，2004，79(2):117.

［5］Kawabata A.Gastrointestinal functions of protease-activated receptors［J］.Life Sci，2003，74(2-3):247.

［6］Lee KR，Betz AL，Kim S，et al.The role of the coagulation cascade in brain edema formation after intracerebral hemorrhage［J］.Acta Neurochir(Wien)，1996，138(4):396-400.

［7］XiG，Keep RF，Hoff JT.Erythrocytes and delayed edema formation following intracerebral hemorrhage in rates［J］.Neurosurg，1998，89(6):991-996.

［8］李現亮，崔才三.自發(fā)性腦出血后腦水腫形成機制的研究進展［J］.山東醫(yī)藥，2006，46(10):74-75.

［9］XiG，Keep RF，Hoff JT.Mechanismsof brain injury after intracerebral hemorrhage［J］.Lencet Neurol，2006，5(1):53-63.

［10］Matsuoka H，Hamada R.Role of thrombin in CNSdamage associated with intracerebral haemorrhage opportunity for pharmacological intervention［J］.CNSDrugs，2002，16(8):509-516.

［11］Masada T，Hua Y，XiG，etal.Overexpression of interleukin-1 receptor antagonist reduces brain edema induced by intracerebral hemorraghe and thrombin［J］.Acta Neurochir Suppl，2003，86 (Suppl):463-467.

［12］李鑫，季楠，趙元立，等.自發(fā)性腦出血后繼發(fā)腦水腫嚴重程度的影響因素［J］.山東醫(yī)藥，2008，48(28):13-15.

［13］Guo H，Liu D，Gelbard H，etal.Activated protein C preventsneuronal apoptosis via protease activated receptors land 3［J］.Neuron，2004，41(4):563.

［14］代大偉，王德生，蔡軍，等.鼠腦內注射凝血酶后水通道蛋白4的表達變化［J］.中國臨床康復，2006，10(30):87.

［15］江漢秋，劉群，劉瑾，等.凝血酶對大鼠腦內MMP-9、MMP-2表達的影響［J］.中風與神經疾病雜志，2006，23(1):76.

［16］Jerius H，Beall A，Woodrum D，et al.Thrombin-induced vasospasm:cellular signaling mecchanisms［J］.Surgery，1998，123 (1):46-50.

［17］Hua Y，Xi G，Keep RF，et al.Plasminogen activator inhibitor-1 induction after experimental intracerebral hemorrhage［J］.Cereb Blood Flow Metab，2002，22(1):55-61.

［18］Ribo M，Montaner J，Molina CA，al.Admission fibrinolytic profile isassociated with symptomatic hemorrhagic transformation in stroke patients treated with tissue plasminogen activator［J］.Stroke，2004，35(9):2123-2127.