韋小瑜，李世軍，游 旅，田克誠，唐光鵬，王定明

空腸彎曲菌(Campylobacterjejuni,C.jejuni)屬于微需氧革蘭氏陰性彎曲菌，是引起人類急性腹瀉常見的人獸共患病原菌[1]。在許多國家的腹瀉患者中所占的比重已居首位，部分國家亦僅次于沙門菌或志賀菌。在發(fā)達國家則居食源性感染首位，同時也是食源性感染性疾病的主要監(jiān)測病原菌。發(fā)展中國家空腸彎曲菌的感染率明顯高于發(fā)達國家，通常為發(fā)達國家的10～100倍[2]。貴州省從2010年開始對感染性腹瀉病例中空腸彎曲菌的感染狀況進行了監(jiān)測，發(fā)現(xiàn)貴州省腹瀉人群中存在空腸彎曲菌的感染，且主要感染人群為嬰幼兒，其檢出率僅次于沙門菌，與志賀菌檢出率相同[3]。空腸彎曲菌作為食源性病原菌，主要是通過食用被污染的食物、水以及奶制品等而感染，因此，對疑似病例進行病原學分析，了解其分子流行病學特征對空腸彎曲菌病的預防和控制具有重要意義。本研究對貴州省8例空腸彎曲菌病疑似病例進行病原學診斷及脈沖場凝膠電泳(Pulsed field gel electrophoresis, PFGE)分析，為貴州省空腸彎曲菌病的確診及分子流行病學特征提供科學依據(jù)。

1 材料和方法

1.1病例資料 8例空腸彎曲菌疑似病例中7例來自2010年4-11月貴州省感染性腹瀉監(jiān)測散發(fā)病例，編號為GZ201001～GZ201007，分別來自貴陽市開陽縣1例、花溪區(qū)1例、金陽新區(qū)1例、云巖區(qū)1例、南明區(qū)2例，小河區(qū)1例，發(fā)病年齡均為1歲以內(nèi)的嬰幼兒，均有大便性狀的改變?nèi)缯骋罕?、水樣便及稀便，腹瀉次數(shù)3～10次/d，病程2～6 d，無發(fā)熱等其他伴隨癥狀；1例來自2012年菌血癥患兒GZ201201，出生11 d，系銅仁市九倉鎮(zhèn)家中生產(chǎn)，因出現(xiàn)“全身皮膚剝脫”就診于遵義醫(yī)院，入院時出現(xiàn)低熱，醫(yī)院抽血作血培養(yǎng)提示“弗朗西斯菌”可疑菌，送貴州省疾病預防控制中心鑒定為空腸彎曲菌可疑菌株。

1.2主要試劑 哥侖比亞培養(yǎng)基(OXOID，英國)，脫纖維羊血及選擇性添加劑(北京友康基業(yè)公司)，限制性內(nèi)切酶SmaI(TaKaRa，大連寶生物)，蛋白酶K(Merck，德國)，Seakem Gold瓊脂糖凝膠(Bio-Rad，美國)。

1.3主要儀器 微氧培養(yǎng)箱為CB150(Binder，德國)；PCR儀為德國80W-Tprofessional Gradient 96，脈沖場凝膠電泳儀為CHEF mapperⅡ型(Bio-Rad，美國)，凝膠成像系統(tǒng)為Gel Doc2000型(Bio-Rad，美國)。

1.2方法

1.2.1細菌分離培養(yǎng) 將可疑菌接種至哥侖比亞選擇性血平板，42 ℃微需氧培養(yǎng)箱(85%N2，10%CO2，5%O2)培養(yǎng)2 d觀察可疑菌落形態(tài)。

1.2.2傳統(tǒng)方法對疑似菌株的鑒定 將可疑菌落進行氧化酶和過氧化氫酶試驗，如皆為陽性，則涂片做革蘭氏染色?？漳c彎曲菌為革蘭氏陰性菌，呈S形、海鷗狀、逗點狀。如以上均符合再做馬尿酸鹽水解試驗，空腸彎曲菌馬尿酸鹽水解試驗陽性。

1.2.3多重PCR方法對疑似菌株的鑒定 按照參考文獻[4]提供的16sRNA、mapA引物序列和參數(shù)對疑似菌株核酸進行擴增，同時采用中國疾病預防控制中心傳染病控制所提供的參考菌株核酸作為陽性對照，超純水作為陰性對照。

1.2.4分離菌株的PFGE分析 PFGE分型分析方法按照PulseNet推薦的空腸彎曲菌PFGE標準方法進行分型，獲得的PFGE圖像應用BioNumerics (Version4.0)軟件進行聚類分析。

2 結(jié) 果

2.1細菌分離培養(yǎng)結(jié)果 可疑菌培養(yǎng)2～3 d后，觀察菌落形態(tài)，菌落不溶血，灰色、扁平、濕潤、有光澤，看上去像水滴，直徑為1～2 mm，邊緣完整、發(fā)亮，符合空腸彎曲菌的菌落形態(tài)特征。

2.2傳統(tǒng)方法鑒定結(jié)果 氧化酶、觸酶、馬尿酸鹽水解試驗均陽性；革蘭染色為革蘭陰性短小桿菌，呈逗點狀、S形、海鷗狀。

2.3多重PCR檢測結(jié)果 8株分離株均獲得857 bp(16sRNA)及589 bp(mapA)兩條特異性條帶，與陽性對照一致。

2.4PFGE帶型 8株空腸彎曲菌菌株經(jīng)限制性內(nèi)切酶SmaI酶切及PFGE 后，產(chǎn)生不同條帶的PFGE 帶型的圖譜，8株菌共分為7個PFGE 帶型，產(chǎn)生7～10條DNA條帶(見圖1)。

圖1貴州省空腸彎曲菌分離株PFGE圖

Fig.1PFGEpatternsofC.jejunistrainsisolatedinGuizhouProvince

M: DNA marker; 1-7: GZ201001-GZ201007;8: GZ201201.

2.5PFGE譜型聚類分析結(jié)果 GZ201004和GZ201005兩株腹瀉病例空腸彎曲菌分離株相似性性為100%，人血培養(yǎng)分離株GZ201201與腹瀉病例分離株GZ201007相似性為66.7%(見圖2)。

3 討 論

貴州省自從1988年報道過12例嬰幼兒空腸彎曲菌病例后[5]，直至2010年，貴州省未見空場彎曲菌的人間病例報告。2010年我們對貴州省腹瀉人群細菌病原譜監(jiān)測中發(fā)現(xiàn)7例疑似空腸彎曲菌感染病例，2012年血培養(yǎng)發(fā)現(xiàn)1例空場彎曲菌病疑似病例，為了對病例進行病原學診斷，了解分子流行病學特征，我們采用傳統(tǒng)生化鑒定和多重PCR鑒定相結(jié)合方法，證實8例均為空腸彎曲菌感染，采用PFGE技術揭示了8株菌株的分子流行病學特征。

圖2貴州省8株空腸彎曲菌PFGE圖譜聚類分析圖

Fig.2Clusteranalysisof8C.jejunistrainsisolatedinGuizhouProvince

傳統(tǒng)的革蘭氏染色、氧化酶和過氧化氫酶試驗可將疑似菌株鑒定為彎曲菌屬，但是不能從種的水平進行鑒定，本研究中采用基于16sRNA、mapA兩個基因的PCR技術將8株可疑細菌鑒定為空腸彎曲菌，結(jié)合病例資料證實了8例疑似病例均為空腸彎曲菌感染所致。

目前空腸彎曲菌的分型方法主要有表型分型和基因分型兩種，表型分型方法常采用血清學分型法，由于血清學分型的分型率和分辨力不高，可靠性和重復性不佳，所以傳統(tǒng)的表型分型法在流行病學調(diào)查中的應用受到限制[6]。PFGE是20世紀80年代出現(xiàn)的分析大分子DNA片段的新技術，檢測的是整個細菌染色體上所有酶切位點的變化，從整體上反映不同菌株全部基因的相關性[7]，該方法的發(fā)展成熟為細菌性傳染病監(jiān)測、傳染源追蹤、傳播途徑調(diào)查和識別等暴發(fā)調(diào)查有著非常重要的意義。為了解貴州省空腸彎曲菌的分子流行病學特征，我們將實驗室分離的8株空腸彎曲菌進行PFGE分析結(jié)果將其為7個PFGE帶型，其中GZ201004和GZ201005兩株腹瀉病例空腸彎曲菌分離株相似性為100%，提示兩株菌株可能為同一來源。其次，聚類分析也顯示了8株菌的相似性僅約為45%，表明8株菌株具有PFGE帶型的多態(tài)性，提示貴州省空腸彎曲菌病疫情防控的復雜性。

本研究為8例空腸彎曲菌病疑似病例的確診提供病原學依據(jù)的同時，揭示了貴州省空腸彎曲菌的分子流行特征，其結(jié)果將為貴州省空腸彎曲菌病疫情的預防和控制提供科學依據(jù)。然而，由于在自然界中，空腸彎曲菌廣泛存在于雞、鴨、牛、羊等家禽，家畜以及鳥類的腸道內(nèi)，構(gòu)成空腸彎曲菌的體外儲存宿主，空腸彎曲菌污染的肉、奶、蛋以及水源等是空腸彎曲菌感染的主要傳染源[8]。因此，空腸彎曲菌病的有效控制應在對人間病例監(jiān)測的同時，需加強動物空場彎曲菌病的防控以及食源性空腸彎曲菌的監(jiān)測。此外，本次研究中采用的病例數(shù)只有8例，受分離菌株的局限，其研究結(jié)果揭示的空腸彎曲菌分子流行特征是否具有充分的代表性尚需進一步研究。

參考文獻：

[1]Wu SY, Zhang LS, Ran L, et al. Epidemiology ofCampylobacterand campylobacteriosis[J].Chin J Food Hyg, 2004, 16(1): 58-61. (in Chinese)

吳蜀豫, 張立實,冉陸.彎曲菌和彎曲菌病的流行現(xiàn)狀[J].中國食品衛(wèi)生雜志,2004,16(1):58-61.

[2]Qiao B, Meng FL, Gu YX, et al. Cloning, expression and antigenicity analysis of the outermembrane protein 18 fromCampylobacterjejuni[J]. Chin J Zoonoses, 2011, 27(1): 41-44. (in Chinese)

喬博,孟凡亮,顧一心，等.空腸彎曲菌外膜蛋白rOMP18的克隆表達及抗原性分析[J].中國人獸共患病學報,2011,27(1):41-44.

[3]Wei XY, Tian KC, You L, et al. Detection and analysis on bacteria etiology for infectious diarrhea cases in Guizhou[J]. Mod Prev Med, 2012, 19(8): 1185-1186. (in Chinese)

韋小瑜,田克誠,游旅,等.貴陽市2010年感染性腹瀉細菌病原學檢測分析[J].現(xiàn)代預防醫(yī)學，2012, 19(8) :1185-1186.

[4]Zhang MJ, Gu YX, Ran L, et al. Multi-PCR identification and virulence genes detection ofCampylobacterjejuniisolated from China[J]. Chin J Epidem, 2007, 28(4): 277-280. (in Chinese)

張茂俊，顧一心，冉陸，等.空腸彎曲菌多重聚合酶鏈反應基因鑒定及其毒力相關基因分析[J].中華流行病學雜志,2007,28(4):377-379.

[5]Huang XC, Wang DM, Lin YG. Etiologic investigation and report of 206 cases infantile diarrhea[J]. J Clin Pediatr, 1988, 6(4): 238-239. (in Chinese)

黃學才,王定明,林永根.206例嬰幼兒腹瀉病原學調(diào)查報告[J].臨床兒科雜志,1988,6(4):238-239.

[6]Chen X, Liu SL, Wu CM, et al. Contamination analysis and PFGE typing ofCampylobacterjejuniisolated from chicken production chain[J]. Chin J Zoonoses, 2012, 28 (10): 1012-1016. DOI: 10.3969/cjz.j.isn.1002-2694.2012.10.011 (in Chinese)

陳荀,劉書亮,吳聰明,等.雞肉生產(chǎn)鏈中空腸彎曲桿菌的污染分析及PFGE分型研究[J].中國人獸共患病學報,2012,28(10) :1012-1016.

[7]Huang JL, Xu HY, Feng J, et al. Pulsed field gel electrophoresis for determining the molecular homology ofCampylobacterjejuniisolates[J]. Acta Microbiol Sin, 2009, 49(4): 0531-0535. (in Chinese)

黃金林,許海燕,姜豐，等.空腸彎曲菌脈沖場凝膠電泳分子檢測方法的建立及應用 [J].微生物學報,2009,49 (4) :0531-0535.

[8]Li XQ, Li ZH, Hu YS. Analysis on pathogen molecular subtyping ofCampylobacterjejunifrom foods in Guangzhou[J]. J Trop Med, 2008, 8(8): 794-795. (in Chinese)

李孝權(quán),李釧華,胡玉山,等. 廣州地區(qū)食品分離空腸彎曲菌的病原及分子分型分析[J].熱帶醫(yī)學雜志,2008,8(8):794-795.