馮 立,王 卓,楊 軍,于 淼,王立強,邱廣斌,翟如波,吳益民

斑點熱(Spotted Fever, SF)是由斑點熱群立克次體(spotted fever group rickettsia, SFGR)引起，經(jīng)蜱(少數(shù)由螨或蚤)傳播的人獸共患自然疫源性疾病, 分布于世界各地。SFGR群內(nèi)種類繁多，目前世界上巳發(fā)現(xiàn)近20種SFGR[1-2]。研究資料表明，由SFGR引起的斑點熱病在我國很多地區(qū)廣泛存在。我國巳分離到的SFGR有西伯利亞(Rickettsiasibirica)、黑龍江(Rickettsiaheilongjiangsis)立克次體，二者巳從蜱和病人分得[3-5]。

東北地區(qū)為我國最早發(fā)現(xiàn)的斑點熱自然疫源地。為了解SFGR在當?shù)孛浇轵绲母腥炯癝FGR種型，我們應(yīng)用PCR方法對黑龍江遜克地區(qū)森林革蜱作了SFGR DNA檢測。

1 材料與方法

1.1蜱標本采集 選擇中俄邊界黑龍江遜克地區(qū)不同生境采用人工布旗法采集蜱類，浸漬于70%酒精溶液中, 分類鑒定后進行DNA提取。

1.2蜱標本DNA提取 取出浸漬于70% 酒精溶液的森林革蜱用生理鹽水洗滌3次, 濾紙吸干，于EP管內(nèi)40 ℃過夜烘干。每只1組用玻璃研磨器研碎，應(yīng)用上海生工生物公司“一管式基因組DNA抽提試劑盒”按說明書操作提取DNA, DNA模板置-20 ℃?zhèn)溆谩?/p>

1.3PCR檢測 采用SFGR外膜蛋白A基因(ompA)和立克次體檸檬酸合成酶基因(gltA)按文獻[1.6]設(shè)計引物，由上海生工生物公司合成。引物序列和擴增條件見表1。

表1 PCR 擴增的目的基因及其引物序列

1.4核酸序列測定及聚類分析 PCR 陽性產(chǎn)物送上海申工生物技術(shù)公司測序。應(yīng)用Internet網(wǎng)中BLAST操作平臺，將測序所得結(jié)果與GenBank中注冊的國際上常見的SFGR相應(yīng)基因進行比較，采用DNAstar及Mega 5.0軟件進行序列分析和聚類分析。

2 結(jié) 果

2.1SFGR 檢測結(jié)果 對調(diào)查地區(qū)采集的森林革蜱(Dermacentorsilvarum)60只(雄、雌各30只)，用SFGRompA引物70p/701n進行PCR檢測。檢出陽性14份, 陽性率為23.33%，其中雄性和雌性蜱標本檢出陽性率分別為13.33%和10.00%。PCR電泳結(jié)果見圖1.2。對ompA陽性蜱標本同時用gltA引物Rpcs877p/Rp1258n進行PCR擴增。隨機選擇2份ompA和gltA擴增陽性標本(XK-36, XK-40)作DNA測序。

2.2核苷酸序列比較 陽性標本XK-36和XK-40的ompA和gltA測序所得基因片段序列對比，二者的相似性均為100%。將XK-36ompA和gltA片段序列分別進行同源性比較和聚類分析。

XK-36ompA基因片段序列去掉兩端引物，將其589 bp片段和GenBank中注冊的主要SFGR的相應(yīng)基因進行同源性比較，結(jié)果與Rikettsiasp.JL-02株關(guān)系最近，同源性達99.30%，兩者僅有3個堿基差異；與Rikettsiaraoultii的同源性為99.18%，與Rikettsiaheilongjiangsis和Rikettsiajaponica的同源性分別為92.90%和92.50%。

XK-36gltA基因片段序列去掉兩端引物，將其331 bp片段和主要SFGR的相應(yīng)基因進行同源性比較，結(jié)果與Rikettsiaraoultii和Rikettsiasibirica同源性均為98.50%；與Rikettsiaheilongjiangsis和Rikettsiajaponica同源性均為98.20%。

圖1ompA基因的PCR擴增

Fig.1PCRamplifiedompAgenesintheticks

M: DNA maker (DL2000); 1: Positive control;

2: Negative control; 3, 4, 6: PCR positive;

5: PCR negative.

圖2gltA基因的PCR擴增

Fig.2PCRamplifiedgltAgenesintheticks

M: DNA maker (DL2000); 1: Positive control;

2: Negative control; 4, 6: PCR positive;

3, 5: PCR negative.

2.3核苷酸序列聚類分析 從圖3ompA基因聚類分析可見，XK-36和Rikettsiasp.JL-02株分類一致和Rikettsiaraoultii株、蒙大拿立克次體與馬賽立克次體同屬一支。從圖4gltA基因聚類分析可見，XK-36和Rikettsiaraoultii和Rikettsiasibirica比較接近，然并非同一支。

圖3XK-36與SFGRompA核苷酸序列聚類分析

Fig.3PhylogeneticanalysisofnucleotidesequencesofexanimatedXK-36ompAgene

圖4XK-36與SFGRgltA核苷酸序列聚類分析

Fig.4PhylogeneticanalysisofnucleotidesequencesofexanimatedXK-36gltAgene

3 討 論

東北地區(qū)生態(tài)環(huán)境和氣溫條件適宜節(jié)肢動物和嚙齒動物生長, 是我國最早發(fā)現(xiàn)的SFGR自然疫源地。該地區(qū)蜱類豐富，優(yōu)勢蜱種為森林革蜱、嗜群血蜱、日本血蜱、全溝硬蜱及長角血蜱，已從前三者分離到2種SFGR—R.sibirica和R.heilongjiangsis[3-5]。

本次調(diào)查證明，黑龍江遜克地區(qū)森林革蜱 SFGR 檢出陽性率為23.33%，具有較高的帶毒率, 雄性和雌性蜱檢出陽性率無差異，說明該地區(qū)存在蜱傳斑點疫源地。同源性比較與聚類分析結(jié)果表明, XK-36ompA基因序列與Rikettsiasp.JL-02同源性達99.30%，而與我國分離的R.heilongjiangsis、R.sibirica和R.mongolotimonae差異較大。gltA同源性分析顯示, XK-36和R.raoultii和R.sibirica比較接近。

Rikettsia. sp. JL-02系從吉林長白山森林革蜱檢測出(2003)，它和前蘇聯(lián)西伯利亞地區(qū)草原革蜱(D.nutallii)檢出的新基因型Rikettsiasp.DnS14的ompA基因序列完全一致[7-9]。由于Rikettsiasp.DnS14首次檢出于西伯利亞地區(qū)草原革蜱(1999)，Rikettsiasp.JL-02和XK-36分別從我國吉林省長白山地區(qū)和黑龍江流域遜克地區(qū)森林革蜱檢測到，三者同屬于東北亞地區(qū)，有著相似的地理環(huán)境和蜱種群分布，推測XK-36與Rikettsiasp.JL-02和Rikettsiasp.DnS14屬于同一基因型。Roux[10]基于rrs基因序列比較,把Rikettsiasp.JL-02與R.heilongjiangsis和R.japonica歸屬于同一簇。以序列比較建立的聚類分析是來自某一基因片段，有時部分基因序列是無法代表整個基因序列。Fournier等人[11]提出了基于基因序列比較的立克次體新種定義標準，采用多個基因綜合比較分析的方法。因此獲得病原體，將有利于從病原學、流行病學及分子生物學作進一步研究。

分子生物學技術(shù)的發(fā)展與應(yīng)用，促進了蜱媒傳染病的自然疫源地調(diào)查研究水平, 通過以蜱為目標, 探索和發(fā)現(xiàn)已知或未知的病原體，及病原體、蜱與疾病的關(guān)糸。本次調(diào)查以PCR檢測與序列分析，表明黑龍江流域遜克地區(qū)森林革蜱攜帶與Rikettsiasp.JL-02基因型一致的SFGR, 該地區(qū)存在斑點熱疫源地。擴大調(diào)查范圍，增加檢測蜱樣本數(shù)量、蜱種與測序樣本數(shù)量，可為斑點熱疫源地的證實提供更可靠依據(jù)。

參考文獻：

[1]Philippe P, Paddock CD, Raoult D. Tick borne rickettsioses around the world: Emerging Diseases challenging old concepts[J]. Clin Microbiol Rev, 2005: 719-756. DOI:10.1128/CMR.18.4.719-756.2005

[2]Walker DH, Paddock CD, Dumler JS, et al. Emerging and re-emerging tick transmitted rickettsial and ehrlichial infections[J]. Med Clin North Am, 2008, 92(6): 1345-1361. DOI: 10.1016/j.mcna.2008.06.002

[3]Lou D, Wu YM, Wang B, et al. A new member of spotted fever group of rickettsiae,RickettsiaHeilongjiangi[J]. Chin J Microbio Immuno, 1985, 7(5): 250-253. (in Chinese)

婁丹, 吳益民, 王冰, 等. 斑點熱立克次體的一個新成員—黑龍江立克次體分離鑒定[J]. 中華微生物學和免疫學雜志, 1985, 7(5): 250-253.

[4]Wu YM, Wei AM, Hu LM, et al. Identification of spotted fever group H-5 strain isolated from the patient blood samples[J]. Chin J Zoonoses, 1998, 14(6): 23-26. (in Chinese)

吳益民, 魏安明, 胡玲美, 等. 從病人分離的斑點熱群立克次體H-5株的鑒定[J]. 中國人獸共患病雜志, 1998,14(6): 23-26.

[5]Wen ST, Yu ES, Xu JG, et al. Contemporary state of the zoonoses in the world[M]. Chengdu: Sichuan Science Press, 2011: 896-928. (in Chinese)

文心田，于恩蔗，徐建國，等. 當代世界人獸共患病學[M].成都: 四川科學技術(shù)出版社，2011: 896-928.

[6]Roux V, Ydkina E, Eremeeva M, et al. Citrate synthase gene comparison, a new tool for phylogenetic analysis, and its application for theRickettsiae[J]. Int J Syst Bacteriol, 1997, 47(2): 252-261. DOI: 10.1099/00207713-47-2-252

[7]Cao WC, Zhan L, De Vlas SJ, et al. Molecular detection of spotted fever groupRickettsiainDermacentorsilvarumfrom a forest area of northeastern China[J]. J Med Entomol, 2008, 45(4): 741-744. DOI: 10.1603/0022-2585(2008)45[741:MDOSFG]2.0.CO;2

[8]Hao YJ, Cao WC, Gao SP, et al. A new of spotted rickettsiaes detected in the area of Changbia mountain, Jilin porvince[J]. Chin J Epidemiol, 2003, 24(12): 1126-1128. (in Chinese)

郝永建, 曹務(wù)春, 高淑萍, 等. 吉林省長白山區(qū)斑點熱立克次體自然疫源地調(diào)查[J]. 中華流行病學雜志, 2003, 24(12): 1126-1128.

[9]Rydkina E, Roux V, Natalia F, et al. New rickettsiae in ticks collected in territories of the former Soviet Union[J]. Emerg Infect Dis, 1999, 5(6): 811-814.

[10]Zhang LJ. Contemporary state ofRickettsiaand rickettsioses[M]. Changchun: Jilin College Press, 2010: 16-30. (in Chinese)

張麗娟. 當代立克次體學與立克次體病[M].長春:吉林大學出版社, 2010: 16-30.

[11]Fournier PE, Dumler JS, Greub G, et al. Gene sequence based criteria for identification of new rickettsia isolates and description ofRickettsiaheilongjiangensissp. nov[J]. J Clin Microbiol, 2003, 41(12): 5456-5465. DOI: 10.1128/JCM.41.12.5456-5465.2003