黃建龍，王昌建 ，鄧國華，譚 丹,，范仲鑫，何世成，朱春霞，汪洪冰，劉道新

禽流感是由正黏病毒科流感病毒屬A型流感病毒引起的一種禽類(家禽和野禽)傳染病，迄今為止，共有16種HA(H1-H16)亞型和9種NA(N1-N9)亞型被鑒定，根據(jù)禽流感病毒致病性和毒力的不同，將禽流感分為高致病性、低致病性和非致病性禽流感。高致病性禽流感的危害很大，大家對其高度關(guān)注，但近年來不斷有國家和地區(qū)有低致病性禽流感疫情的報道[1-6]，其流行和傳播呈上升趨勢。很多報道顯示H9亞型禽流感是影響我國養(yǎng)禽業(yè)的主要禽流感病毒亞型，且對禽的危害越來越嚴(yán)重，除引起上呼吸道感染、產(chǎn)蛋量嚴(yán)重下降外，個別毒株可引發(fā)較大的死亡。近年來我國南方地區(qū)和香港均出現(xiàn)了人感染H9N2亞型AIV的病例[7]。有報道稱H6亞型禽流感病毒不僅可以向H5亞型高致病性禽流感病毒和H9N2亞型禽流感病毒提供內(nèi)部基因片段，而且還可以感染鼠、水貂和人[8-9]。

為了加強活禽經(jīng)營市場管理，規(guī)范活禽經(jīng)營行為，為了解環(huán)洞庭湖地區(qū)主要活禽批發(fā)市場低致病性禽流感病毒的分布和流行情況，從而有效預(yù)防和控制禽流感，保護人體健康和公共衛(wèi)生安全。2009-2011年冬春季節(jié)，我們對環(huán)洞庭湖活禽批發(fā)市場家禽進行低致病性禽流感監(jiān)測，為該地區(qū)活禽批發(fā)市場低致病性禽流感的防控措施提供一些依據(jù)。

1 材料與方法

1.1樣品采集 按隨機抽樣的方法,每年的冬季和春季到每個市場抽取10個經(jīng)營戶，每戶采10對咽喉拭子和泄殖腔拭子，采樣時詳細記錄家禽產(chǎn)地、日齡、采樣數(shù)量等信息。

1.2主要試劑 Taq DNA聚合酶、dNTPs和分子量Marker均購自寶生物工程(大連)有限公司；反轉(zhuǎn)錄酶、LS TRIzol RNA提取試劑購自Invitrogen公司。

1.3雞胚 SPF雞胚購自哈爾濱獸醫(yī)研究所實驗動物中心。

1.4病原分離和鑒定 拭子樣品1 000 r/min離心5 min，吸取上清液，以每胚0.2 mL的注射劑量由尿囊腔接種9～10 d齡SPF雞胚，每個樣品接種2～3枚SPF雞胚，37 ℃孵育，每天觀察2次，棄去24 h內(nèi)死亡的雞胚，及時收集之后死亡雞胚，至96 h收集所有雞胚，置于4 ℃過夜，收獲雞胚尿囊液，用血凝試驗(HA)測定，陰性者再盲傳1代，如果HA認為陰性，則終定為陰性樣品。對HA測定有滴度的再進行血凝抑制試驗(HI)和RT-PCT方法相結(jié)合鑒定病毒的亞型。

2 結(jié) 果

2.1總體檢測情況 2009-2011年，對環(huán)洞庭湖區(qū)主要活禽批發(fā)市場禽流感進行監(jiān)測，共采集2 819對拭子，經(jīng)病原分離和鑒定發(fā)現(xiàn)，有627對拭子為低致病性禽流感陽性拭子，總的分離率為22.2%，其中鴨拭子低致病性禽流感的分離率最高為24.6%，其次是雞拭子，達21.5%，鵝拭子為11%，見表1。

表1 總體檢測結(jié)果

2.2各個活禽批發(fā)市場低致病性禽流感分離率 在所監(jiān)測的5家活禽批發(fā)市場中都檢出陽性樣品,其中益陽市學(xué)門口市場、長沙市石馬家禽批發(fā)市場和岳陽市楓橋胡蛋禽批發(fā)市場低致病性禽流感分離率較高，分別為27.4%、27.3%和23.0%。

2.3不同HA亞型低致病性禽流感分離率 3年的持續(xù)監(jiān)測過程中，在活禽批發(fā)市場的禽拭子中分離出了6種亞型的低致病性禽流感病毒，有H3亞型、H4亞型、H6亞型、H9亞型、H10亞型和H11亞型。其中H9亞型、H6亞型和H4亞型比較高，其分離率分別可達到11%、6.3%和3.4%。

2.4活禽批發(fā)市場低致病性禽流感隱性帶毒種群分布情況 在對所采集的雞、鴨、鵝拭子中都檢測到禽流感病毒。在鴨拭子中可以分離到有H3、H4、H6、H9、H10和H11等6種亞型的低病性禽流感病毒，并且AIV H6亞型隱性帶毒率最高，達到10.2%。在雞拭子中可以分離到有H3、H4、H6和H9型等4種低病性禽流感病毒，其AIV H9亞型隱性帶毒率最高，達到15.1%。在鵝拭子中可以分離到有H4、H6和H9等3種亞型低病性禽流感病毒，見圖1。

圖1活禽批發(fā)市場中雞、鴨、鵝不同HA亞型低致病性禽流感分離率

Fig.1PositiverateofdifferentHAsubtypesoflowpathogenicavianinfluenzainchickens,ducksandgeeseinlivepoultrywholesalemarket

3 討 論

這3年的持續(xù)監(jiān)測過程中，每年環(huán)洞庭湖區(qū)主要活禽批發(fā)市場低致病性禽流感病毒分離率都不低。并在所監(jiān)測的5家活禽批發(fā)市場中都分離到低致病性禽流感病毒，分離出有H3、H4、H6、H9、H10型和H11等6種亞型的禽流感病毒。表明在活禽批發(fā)市場中低致病性禽流感隱性帶毒的情況普遍存在，活禽批發(fā)市場發(fā)生禽流感疫情的威脅比較大。目前，我們市場的禽流感檢疫水平不是很高，這就需要我們加強對活禽批發(fā)市場中家禽特別是水禽的病原學(xué)監(jiān)測和家禽的抗體水平監(jiān)測。

水禽特別是家鴨是禽流感病毒的儲存庫和傳染源，由于家鴨經(jīng)常同時被多個亞型的禽流感病毒混合感染，這為各亞型的基因重組提供了很好的載體，禽流感病毒在水禽與陸禽間傳播，可加快表面蛋白的變異，不斷豐富內(nèi)部基因的重配，并加速了種間傳播的機會[10-11]。因此，其在流感病毒的進化和生態(tài)分布的重要地位已經(jīng)得到廣泛認可。在對洞庭湖區(qū)活禽批發(fā)市場所采集的雞、鴨、鵝拭子檢測中發(fā)現(xiàn)，鴨拭子低致病性禽流感的分離率最高，達到24.6%，并且在鴨拭子中可以檢測到的低致病性禽流感病毒亞型最多，有H3、H4、H6、H9、H10和H11等6種亞型。通過問卷調(diào)查發(fā)現(xiàn)省內(nèi)低致病性禽流感隱性帶毒鴨拭子主要來源于長沙、益陽、岳陽和常德，表明洞庭湖區(qū)的水禽低致病性禽流感隱形帶毒是很高的，從而較大地威脅該地區(qū)發(fā)生禽流感疫情。因此，必須盡量防止野生水禽、家養(yǎng)水禽及其它野鳥與陸禽間的相互接觸，在市場禽流感的防控方面，水禽和其它禽類應(yīng)分別建立市場，獨立經(jīng)營。

在雞拭子中可以檢測到有5種亞型低致病性禽流感病毒，這說明雞低致病性禽流感隱性帶毒也是很嚴(yán)重的。根據(jù)我們的調(diào)查和分析，活禽批發(fā)市場上的雞低致病性禽流感隱性帶毒如此之高，原因可能有以下2個方面：第一，市場上的淘汰蛋雞比較多，蛋雞感染H9亞型的幾率比較大，有些養(yǎng)殖場的雞可能感染了H9亞型禽流感導(dǎo)致產(chǎn)蛋下降而緊急淘汰這部分蛋雞；第二，有些雞可能來源于運輸過程中的感染或市場內(nèi)陽性帶毒鴨把病毒傳播給雞的。有專家預(yù)測H9N2亞型禽流感病毒可能成為毒力較強的毒株，成為下次流感大流行的亞型[12]。

本次監(jiān)測中，鵝拭子的監(jiān)測數(shù)量不是很多，但是在鵝拭子中檢測到有H4、H6和H9等3種亞型低病性禽流感病毒，說明鵝在流感病毒的進化和生態(tài)分布的作用同樣不可忽視，須繼續(xù)加強和重視對各種家禽禽流感的監(jiān)測。

參考文獻：

[1]Peng Y, Zhang W, Xue F, et al. Etiological examination on the low pathogenicity avian influenza viruses with different HA subtypes from poultry isolated in eastern China from 2006 to 2008[J]. Chin J Zoonoses, 2009, 25(2): 119-121.(in Chinese)

彭宜,張偉,薛峰,等. 2006-2008年對華東地區(qū)家禽不同HA亞型低致病性禽流感的病原學(xué)監(jiān)測[J].中國人獸共患病學(xué)報, 2009, 25(2): 119-121.

[2]Zhao G, Zhong L, Zhao KK, et al. Isolation and characterization of H3N2 influenza viruses from ducks[J].Acta Veterinaria et Zootechnica Sinica, 2010, 41(10): 1354-1358.(in Chinese)

趙國, 鐘蕾,趙坤坤,等. 2株鴨源H3N2亞型流感病毒的分離鑒定和遺傳進化分析[J].畜牧獸醫(yī)學(xué)報, 2010, 41(10): 1354-1358.

[3]Luo WY, Hu YH, Deng GH, et al. Sequence analysis and pathogenicity of 2 H6N2 subtype AIV isolates from geese in Guangdong[J]. Chin J Prev Vet Med, 2012, 34(5): 345-349.(in Chinese)

羅維玉,胡永浩,鄧國華, 等.兩株鵝源H6N2亞型禽流感廣東分離株的全序列分析及致病性研究[J].中國預(yù)防獸醫(yī)學(xué)報, 2012, 34(5): 345-349.

[4]Zhou JP, Liu J, Li KH, et al. Survey of H9 subtype avian influenza virus in live poultry markets of Shanghai[J]. Chin J Anim Infect Dis, 2010, 18(3): 56-61.(in Chinese)

周錦萍,劉健,李凱航,等.上海地區(qū)活禽批發(fā)市場H9亞型禽流感病毒調(diào)查[J]. 中國動物傳染病學(xué)報, 2010, 18(3): 56-61.

[5]Li QZ, Cao MH, Jiang X. Research on low pathogenic avian influenza (H9) subtype in the Liaoning Province[J]. Mod J Anim Husb Vet Med, 2012, 6: 31-32.(in Chinese)

李清竹,曹明慧,姜新.遼寧省低致病性禽流感(H9)亞型帶毒情況調(diào)查研究[J]. 現(xiàn)代畜牧獸醫(yī), 2012, 6: 31-32.

[6]Abolnik C, Bisschop S, Gerdes T, et al. Outbreaks of avian influenza H6N2 viruses in chickens arose by a reassortment of H6N8 and H9N2 ostrich viruses[J]. Virus Genes, 2007, 34(1): 37-45.

[7]Butt KM, Smith GJD, Chen H, et al. Human infection with an avian H9N2 influenza A virus in Hong Kong in 2003[J]. J Clin Microbiol, 2005, 43(11): 5760-5767.DOI:10.1128/JCM.43.11.5760-5767.2005

[8]Chen YM, Ge WY, Huang C, et al. Serological survey of antibody to H9 and H6 subtypes of bird flu virus in healthy youths in Guangxi[J]. China Trop Med, 2008, 8(6): 985-986.(in Chinese)

陳妍梅,葛萬運,黃川,等.廣西健康青年H9、H6亞型禽流感病毒血清抗體調(diào)查[J].中國熱帶醫(yī)學(xué), 2008, 8(6): 985-986.

[9]Gillim-Ross L, Santos C, Chert Z, et al. Avian influenza h6 viruses productively infect and cause illness in mice and ferrets[J]. J Virol, 2008, 82(21): 10854-10863.DOI:10.1128/JVI.01206-08

[10]Songserm T, Jam-on R, Sae-Heng N, et al. Domestic ducks and H5N1 influenza epidemic, Thailand[J]. Emerg Infect Dis, 2006, 12(4): 575-581.DOI:10.3201/eid1204.051614

[11]Smith GJ, Fan XH, Wang J, et al. Emergence and predominance of an H5N1 influenza variant in China[J]. Proc Natl Acad SciU S A, 2007, 103(45): 16936-16941.DOI:10.1073/pnas.0608157103

[12]Xu KM, Li KS. H9 maybe the next human influenza pandemic subtypes[J]. Foreign Med (Microbiol Sect), 2003(2): 7-9.(in Chinese)

徐克敏,李康生.H9可能是人類下次流感大流行的亞型[J].國外醫(yī)學(xué)(微生物學(xué)分冊), 2003(2): 7-9.