朱 濤，趙艷豐，唐小牛，谷生麗，王少圣，李朝品

表皮葡萄球菌(Staphylococcusepidermidis, SE)屬凝固酶陰性葡萄球菌，為條件致病菌，廣泛存在于人皮膚和粘膜表面，其正常情況下很少引起感染。但近年來，隨著醫(yī)用高分子材料(如人工關(guān)節(jié)、人工心臟瓣膜和中央靜脈插管等)在臨床上的廣泛應(yīng)用，表皮葡萄球菌日益成為引起院內(nèi)感染的重要病原體之一。其致病性主要在于能在醫(yī)用材料表面形成生物膜(biofilm)[1-2]。生物膜的形成受多種環(huán)境因素的影響。雙組分調(diào)控系統(tǒng)(Two-component regulatory system,TCS)是細(xì)菌感應(yīng)外界環(huán)境信號，啟動(dòng)胞內(nèi)一系列相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄和表達(dá)，以增強(qiáng)細(xì)菌在不同環(huán)境下的適應(yīng)能力和調(diào)控細(xì)菌毒力的一類信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑[3-4]。研究表明多個(gè)雙組分調(diào)控系統(tǒng)YycG/F、ArlS/R和SrrB/A參與調(diào)控葡萄球菌生物膜的形成[5-7]。

作者在以往的研究中對表皮葡萄球菌雙組分信號轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)LytS/R的生物學(xué)功能和調(diào)控網(wǎng)絡(luò)作了初步分析。研究發(fā)現(xiàn)lytS/R基因被敲除后，其利用丙酮酸作為碳源的能力顯著受損?；蛐酒慕Y(jié)果表明參與丙酮酸代謝的相關(guān)基因mqo-2和mqo-3的轉(zhuǎn)錄水平明顯下降。而且鄰近mqo-2的serp2169基因的轉(zhuǎn)錄水平也下調(diào)了60倍，但其功能未知[8]。Petrova等人研究表明丙酮酸以及丙酮酸的發(fā)酵是銅綠假單胞菌形成微菌落，進(jìn)而形成生物被膜所必須的[9]。因此，為了研究serp2169基因的生物學(xué)功能以及是否參與丙酮酸代謝和影響生物膜形成，我們擬構(gòu)建表皮葡萄球菌serp2169基因敲除突變株，并對突變株的表型進(jìn)行初步檢測。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1菌株和質(zhì)粒 表皮葡萄球菌1457株為臨床株，由本實(shí)驗(yàn)室保存；穿梭質(zhì)粒pMAD-spc、大腸桿菌DH5α和金黃色葡萄球菌RN4220，用于基因敲除。

1.1.2主要試劑和培養(yǎng)基 溶葡萄球菌素(lysostaphin)、Pfu DNA聚合酶、紅霉素(Erythromycin)、X-gal、瓊脂糖凝膠回收試劑盒購自上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司；壯觀霉素(Spectinomycin)購自Sigma公司；限制性內(nèi)切酶、DNA連接酶、lkb DNA Marker購自Fermentas公司；質(zhì)粒抽提試劑盒購自Qiagen公司；引物合成和測序由上海生工生物技術(shù)有限公司完成；TSB( Tryptic Soy Broth) 為美國BD公司產(chǎn)品；BM培養(yǎng)基：10 g/L 蛋白胨，5 g/L 酵母提取物，5 g /L氯化鈉，1 g/L磷酸氫二鉀，1 g/L葡萄糖。

1.2 方法

1.2.1表皮葡萄球菌serp2169基因的生物信息學(xué)分析 根據(jù)表皮葡萄球菌ATCC35984株全基因組序列(GenBank收錄號：CP000029)[10]，找到serp2169基因及其編碼的蛋白序列。采用BlastP在線軟件對其編碼蛋白SERP2169的同源性和蛋白功能域進(jìn)行分析。

1.2.2表皮葡萄球菌serp2169基因敲除突變株的構(gòu)建 采用質(zhì)粒同源重組的方法構(gòu)建表皮葡萄球菌1457serp2169基因敲除突變株(Fig.1)[11]。根據(jù)NCBI上公布的表皮葡萄球菌基因組序列，在serp2169基因的上下游各設(shè)計(jì)1對引物，上游引物為serp2169-UF和serp2169-UR，擴(kuò)增片段長度1 011 bp，作為上游同源臂；下游引物為serp2169-DF和serp2169-DR，擴(kuò)增片段長度988 bp，作為下游同源臂；擬用spc基因取代819 bp的serp2169目的基因。所用引物采用Primer Premier 5.0軟件設(shè)計(jì), 引物序列的下劃線為酶切位點(diǎn)(表1)。

提取表皮葡萄球菌1457株基因組DNA，以該基因組DNA為模板擴(kuò)增上下游同源臂，克隆入pMAD-spc載體，得到同源重組質(zhì)粒，命名為pMAD-serp2169。通過電轉(zhuǎn)將pMAD-serp2169轉(zhuǎn)入金黃色葡萄球菌RN4220，電轉(zhuǎn)條件：電壓2 kV，電容25 μF ，電阻100 Ω。在含有10 mg/L紅霉素的BM平板上篩選出轉(zhuǎn)化成功的菌落后，提取金黃色葡萄球菌RN4220中的pMAD-serp2169并鑒定，再把經(jīng)修飾的pMAD-serp2169電轉(zhuǎn)入表皮葡萄球菌1457株，電轉(zhuǎn)條件同前。

pMAD是溫度敏感型質(zhì)粒，30℃此質(zhì)?？梢栽诟锾m陽性菌中穩(wěn)定存在，當(dāng)溫度≥40℃時(shí)質(zhì)粒很易丟失。該質(zhì)粒攜帶lacZ基因，編碼β半乳糖苷酶，能分解生色底物X-gal 產(chǎn)生藍(lán)色。當(dāng)同源重組未發(fā)生時(shí)，質(zhì)粒保留在細(xì)菌內(nèi)，或者與基因組只發(fā)生了單交換，lacZ基因表達(dá)，菌落呈藍(lán)色；當(dāng)同源重組發(fā)生后，質(zhì)粒從細(xì)菌丟失，無β半乳糖苷酶表達(dá)，菌落呈白色。根據(jù)以上原則進(jìn)行敲除突變株的篩選。取含pMAD-serp2169的表皮葡萄球菌1457株接種含10 mg/L紅霉素的BM培養(yǎng)基，30℃培養(yǎng)過夜。取1 mL上述菌液接種新鮮100 mL含50 mg/L 壯觀霉素的BM培養(yǎng)基，42℃振蕩培養(yǎng)24 h；以下同前，共重復(fù)2～3次，每天需換新鮮含50 mg/L壯觀霉素的BM培養(yǎng)基。取少量菌液接種至含50 mg/L壯觀霉素，20 g/L X-gal的TSB平板；挑取單個(gè)白色菌落分別接種至含50 mg/L壯觀霉素的和含10 mg/L紅霉素的TSB平板，其中壯觀霉素平板上生長、紅霉素平板上不生長的菌落為初篩重組成功的serp2169基因敲除突變株，命名為SE1457-Δserp2169。

1.1.3表皮葡萄球菌serp2169基因敲除突變株的鑒定 以初篩所得的突變株基因組為模板，以上游同源臂外側(cè)的正義引物(serp2169-IF)和spc基因片段的反義引物(spc-IR)，下游同源臂外側(cè)的反義引物(serp2169-IR)和spc基因片段的正義引物(spc-IF)，分別采用Pfu DNA聚合酶進(jìn)行PCR擴(kuò)增，并以表皮葡萄球菌1457野生株基因組作為陰性對照。所用引物采用Primer Premier 5.0軟件設(shè)計(jì),具體序列見表1。如若同源重組成功，spc基因取代了目的基因serp2169，則突變株能夠擴(kuò)增出預(yù)計(jì)大小的片段，反之則不能。將PCR產(chǎn)物行1%瓊脂糖凝膠電泳，根據(jù)1 kb DNA Marker得出產(chǎn)物大小，并與陰性對照比較。最后對PCR產(chǎn)物進(jìn)行凝膠回收后測序驗(yàn)證。

表1 各擴(kuò)增片段的引物序列及限制性內(nèi)切酶

Note: This table shows primers and restriction endonuleases used in the present study, and underlined sequences represent the restriction sites. Upstream and downstream fragments of theserp2169 gene were amplified byserp2169-UF,serp2169-URserp2169-DF, andserp2169-DR, respectively. Primersserp2169-IF,spc-IR,spc-IF, andserp2169-IR were used to identifySE1457-Δserp2169 by PCR amplification, respectively.

1.2.3serp2169突變株及其野生株生長曲線和培養(yǎng)液pH值的測定 將過夜培養(yǎng)的菌液接種于含100 mL TSB培養(yǎng)基的500 mL錐形瓶中，調(diào)節(jié)接種量，使得OD600=0.01。將錐形瓶置于37℃氣浴恒溫振蕩器中，220 r/min振蕩培養(yǎng)，分別于4、8、12、24 h后取樣，以后每隔24 h取樣一次，測定OD600值和pH值，共檢測168 h。

1.1.4serp2169突變株及其野生株生物膜形成的半定量檢測 細(xì)菌經(jīng)過37℃振蕩培養(yǎng)過夜，1∶200稀釋加入96孔板(200 μL/孔，三復(fù)孔)，并且用TSB培養(yǎng)基為空白對照，另設(shè)表皮葡萄球菌ATCC12228為陰性對照，表皮葡萄球菌ATCC1457為野生株。37 ℃靜置培養(yǎng)24 h，丟棄菌液，加入PBS(200 μL/孔)，洗去未黏附細(xì)菌，重復(fù)洗滌3次。然后加入99%甲醇固定15 min，棄甲醇。加入2%結(jié)晶紫染色8 min，自來水沖洗板到流水無色，室溫干燥片刻后，酶標(biāo)儀于570 nm處讀數(shù)[11]。

2 結(jié) 果

2.1表皮葡萄球菌serp2169基因的生物信息學(xué)分析 BlastP分析表明表皮葡萄球菌serp2169基因的編碼氨基酸序列中4-272位為PRK05339結(jié)構(gòu)域。該結(jié)構(gòu)域暫被認(rèn)為屬于磷酸烯醇式丙酮酸合成酶調(diào)節(jié)蛋白。serp2169的同源基因普遍存在于凝固酶陰性葡萄球菌中，在溶血葡萄球菌中氨基酸序列一致性為87%，在肉葡萄球菌中氨基酸序列一致性為72%，而在金黃色葡萄球菌中未發(fā)現(xiàn)氨基酸序列一致性大于50%的同源基因。對serp2169基因的上下游序列進(jìn)行分析，serp2169上游為mqo-2基因，編碼蘋果酸:醌氧化還原酶(malate:quinone oxidoreductase)；其下游為ppdk基因，編碼丙酮酸磷酸雙激酶(pyruvate phosphate dikinase)(圖1)。

2.2表皮葡萄球菌serp2169基因敲除突變株的構(gòu)建和鑒定 經(jīng)PCR擴(kuò)增和雙酶切驗(yàn)證，成功構(gòu)建了同源重組質(zhì)粒pMAD-serp2169。轉(zhuǎn)化了pMAD-serp2169的表皮葡萄球菌于42 ℃條件下連續(xù)傳代，篩選出了對壯觀霉素抵抗但對紅霉素敏感的白色菌落。以同源臂外側(cè)基因序列和spc基因序列設(shè)計(jì)的兩對引物對篩選出的突變株和野生株分別進(jìn)行PCR擴(kuò)增，結(jié)果顯示篩選出的突變株能夠擴(kuò)增出長度約2 117 bp和1 933 bp的片段，與預(yù)計(jì)的片段大小相符，且通過測序證實(shí)；而野生株不能擴(kuò)增出相應(yīng)的片段 (圖2)。采用梅里埃API STAPH葡萄球菌鑒定試劑條對篩選出的突變菌株進(jìn)行菌種鑒定，結(jié)果顯示為表皮葡萄球菌，證明獲得了SE1457-Δserp2169菌株。

圖1serp2169基因同源重組及其上下游序列分析

Fig.1Homologousrecombinationofserp2169geneinS.epidermidis1457genomewithpMAD-serp2169andtheanalysisofitssurroundingregion

The upstream and downstream fragment ofserp2169 gene andspcwere cloned into vector pMAD-spc, named as pMAD-serp2169.

圖2表皮葡萄球菌serp2169基因敲除突變株的PCR鑒定

Fig.2Identificationofserp2169geneknockingoutintheS.epidermidisbyPCRamplification

Specific fragments were amplified fromSE1457-Δserp2169;

M: 1 kb DNA marker;

Lane 1:serp2169 upstream fragment plusspcfragment (2 117 bp);

Lane 2:serp2169 downstream fragment plusspcfragment (1 933 bp);

Lane 3 and Lane 4: no fragment was amplified from the wild type strain by using the respective primers.

2.3serp2169突變株生長曲線和培養(yǎng)液pH值的研究 在相同接種量和生長條件下比較野生株和突變株的生長曲線，結(jié)果顯示兩株細(xì)菌的生長曲線在96 h以前基本一致，培養(yǎng)24 h后，濁度值達(dá)到最高，突變株OD600=2.602，野生株OD600=2.646，隨后逐漸下降；兩株細(xì)菌培養(yǎng)液的pH值也基本一致。而在96 h以后野生株的生長曲線出現(xiàn)反彈，而突變株的生長曲線繼續(xù)下行，培養(yǎng)120 h后，突變株OD600=0.883，野生株OD600=1.701 (圖3)，此時(shí)兩株細(xì)菌培養(yǎng)液的pH值也出現(xiàn)了差別，突變株pH=8.35，野生株pH=7.96。

圖3表皮葡萄球菌serp2169基因敲除突變株和野生株的生長曲線

Fig.3GrowthcurveofSE1457-Δserp2169andthewildtypestrain

(△):SE1457-Δserp2169;

(○):SE157 wild type strain.

Overnight culture was diluted to OD600=0.01 in 200 mL TSB medium, and incubated at 37 ℃ with shaking.

The value of OD600was detected.

The curves represent one of the three independent experiments.

2.4serp2169突變對表皮葡萄球菌生物膜形成能力的影響 對敲除突變株進(jìn)行微量板半定量生物膜檢測，觀察細(xì)菌在96孔板上靜止生長24 h后生物膜的形成，結(jié)果顯示突變株的OD570=2.436，而野生株OD570=2.329，P>0.05，與野生株相比，突變株的生物膜形成能力無顯著變化 (圖4)。

3 討 論

本研究根據(jù)同源重組原理，采用溫度敏感型質(zhì)粒pMAD結(jié)合藍(lán)白斑篩選技術(shù)，成功獲得了表皮葡萄球菌serp2169基因的敲除突變株，為其下一步生物學(xué)功能的研究奠定了基礎(chǔ)。serp2169基因的生物信息學(xué)分析表明其編碼產(chǎn)物可能為磷酸烯醇式丙酮酸合成酶調(diào)節(jié)蛋白。且其上游的mqo-2基因編碼蘋果酸:醌氧化還原酶，催化蘋果酸氧化生成草酰乙酸，參與三羧酸循環(huán)和乙醛酸循環(huán)[13]；而下游的ppdk基因編碼丙酮酸磷酸雙激酶，主要分布在特定的微生物和植物體內(nèi)，可逆地催化ATP、磷酸和丙酮酸轉(zhuǎn)化為AMP、焦磷酸和磷酸烯醇式丙酮酸[14-15]，均參與丙酮酸的代謝。表皮葡萄球菌lytS/R突變株利用丙酮酸的能力受限，且serp2169基因的轉(zhuǎn)錄水平顯著降低。因此，serp2169基因可能參與丙酮酸的代謝，并在表皮葡萄球菌利用丙酮酸作為碳源的代謝過程中發(fā)揮重要調(diào)節(jié)作用。但我們觀察了serp2169突變株在丙酮酸利用培養(yǎng)基(10 g/L丙酮酸, 10 g/L蛋白胨，5 g/L酵母提取物，5 g/L氯化鈉，1 g/L磷酸氫二鉀)中的生長情況，發(fā)現(xiàn)其與野生株并無差異。

圖4serp2169突變對表皮葡萄球菌生物膜形成能力的影響

Fig.4Effectofserp2169geneknockingoutonS.epidermidisbiofilmformation

The biofilm formation ofSE1457-Δserp2169 and its parent strain was detected by semi-quantitative microtiter plate assay.

Briefly, the overnight bacterial were diluted by 1∶200 and cultured in 96-well plate (200 μL/well) at 37 ℃ for 24 h.

The well was washed by PBS for 3 times, fixed by 99% methanol and stained with crystal violet.

Data are means ± SEM of three independent experiments.

進(jìn)一步，我們對突變株和野生株的生長曲線進(jìn)行了測定，發(fā)現(xiàn)在對數(shù)期以及平臺(tái)期的早期，兩株細(xì)菌的生長并無差異；而到了平臺(tái)期的后期(96 h)，野生株有一個(gè)二次生長的過程，但突變株沒有，兩株細(xì)菌的生長曲線出現(xiàn)了差異，同時(shí)培養(yǎng)液的pH值突變株也比野生株偏堿性。金黃色葡萄球菌cidC基因編碼丙酮酸激酶，能催化丙酮酸氧化脫羧生成乙酸和二氧化碳。與野生株相比，cidC敲除突變株在平臺(tái)期有一個(gè)二次生長的過程, 作者認(rèn)為這是由于突變株中乙酸的濃度適合作為碳源進(jìn)行能量代謝的結(jié)果，而野生株中因cidC基因的存在而造成乙酸濃度過高，從而影響了細(xì)菌的生存[16]?？漳c彎曲菌在平臺(tái)期也有一個(gè)二次生長的過程，形成雙峰生長曲線，Martínez-Rodriguez等人也認(rèn)為這是丙酮酸的代謝產(chǎn)物乙酸在平臺(tái)期被作為碳源進(jìn)行代謝的結(jié)果[17-18]。綜上所述，我們推測在表皮葡萄球菌中也存在利用乙酸或者丙酮酸的其他代謝產(chǎn)物作為碳源進(jìn)行能量代謝的機(jī)制，而serp2169基因可能是參與這一機(jī)制的關(guān)鍵基因。

細(xì)菌的代謝狀態(tài)可影響生物膜的形成，抑制三羧酸循環(huán)可促進(jìn)生物膜形成能力增強(qiáng)[19]。因此，我們檢測了serp2169突變株的生物膜形成情況，發(fā)現(xiàn)與野生株相比無顯著變化，表明serp2169基因可能不影響表皮葡萄球菌生物膜的形成。

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