熊浩明，魏柏青，祁美英，李存香，楊曉艷，辛有全，魏榮杰，靳 娟，代瑞霞

青海省位于青藏高原東北部，東經(jīng)89°35′～103°04′，北緯31°40′～39°19′，東西長(zhǎng)1 200 km，南北寬800 km，面積72.12萬(wàn)km2。屬于高原大陸性氣候，具有氣溫低、晝夜溫差大、降雨少而集中、日照長(zhǎng)、太陽(yáng)輻射強(qiáng)等特點(diǎn)。有喜馬拉雅旱獺鼠疫自然疫源地和青海田鼠鼠疫自然疫源地2種類(lèi)型的疫源地，是我國(guó)鼠疫危害最嚴(yán)重的地區(qū)之一。不同類(lèi)型的鼠疫自然疫源地由于地理分布、主要宿主動(dòng)物以及鼠疫菌的生化性狀不同,鼠疫菌的毒力也存在差異。本文對(duì)青海省分離的392珠鼠疫菌進(jìn)行毒力測(cè)定，并輸入青海省地方病防治地理信息系統(tǒng)數(shù)據(jù)庫(kù)，用QHEndem ic-GIS軟件對(duì)青海省392株鼠疫菌毒力的空間分布進(jìn)行描述和分析，以便為青海省鼠疫防治提供科學(xué)依據(jù)。

1 資料與方法

1.1菌株來(lái)源 以1954-2012年青海省內(nèi)不同地區(qū)、宿主、媒介體內(nèi)分離的鼠疫菌392株作為實(shí)驗(yàn)對(duì)象。所有菌株均由青海省國(guó)家鼠疫菌種保藏中心提供。

1.2實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 昆明系小白鼠(以下簡(jiǎn)稱小鼠), 體重18～20 g，購(gòu)自青海省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。

1.3毒力測(cè)定 將每株菌的37 ℃24 h培養(yǎng)物用滅菌生理鹽水制成菌懸液，菌懸液原液濃度大于20億個(gè)菌/mL，用標(biāo)準(zhǔn)比濁管比濁稀釋成7億個(gè)菌/mL，計(jì)算制成的菌懸液原液的實(shí)際濃度，稀釋為2×101個(gè)菌/mL、2×102個(gè)菌/mL、2×103個(gè)菌/mL、2×104個(gè)菌/mL、2×105個(gè)菌/mL、2×106個(gè)菌/mL、2×107個(gè)菌/mL、2×108個(gè)菌/mL、2×109個(gè)菌/mL。劑量組小鼠皮下注射0.5 mL，每組5只，攻毒劑量為101個(gè)菌、102個(gè)菌、103個(gè)菌、104個(gè)菌、105個(gè)菌、106個(gè)菌、107個(gè)菌、108個(gè)菌、109個(gè)菌。同時(shí)用100個(gè)菌接種平皿，28 ℃培養(yǎng)72 h計(jì)算其活菌數(shù)。小鼠觀察飼養(yǎng)14 d，死亡的小鼠當(dāng)天解剖，取肝、脾做細(xì)菌培養(yǎng)和鼠疫噬菌體裂解試驗(yàn)，培養(yǎng)出鼠疫菌者為特異性死亡，否則為非特異性死亡。用SPSS 21.0軟件計(jì)算每株鼠疫菌對(duì)小鼠的半數(shù)致死量(LD50)和95%的可信范圍[1]。

1.4QHEndem ic-GIS數(shù)據(jù)庫(kù)的建立和制圖 將每株鼠疫菌分離的宿主、媒介、分離地點(diǎn)、地理編碼、輸入數(shù)據(jù)庫(kù)。用QHEndem ic-GIS軟件導(dǎo)入數(shù)據(jù)庫(kù)數(shù)據(jù)后，用青海省地圖按照不同的制圖要求進(jìn)行參數(shù)字段分類(lèi)并賦予相應(yīng)的顏色顯示，插入圖例和標(biāo)題后輸出。

2 結(jié) 果

2.1毒力測(cè)定結(jié)果及空間分布 青海省392株鼠疫菌對(duì)小鼠毒力測(cè)定結(jié)果：LD50小于100的菌株有323珠，占82.39%；LD50大于等于100小于1 000的菌株有44珠，占11.22%；LD50大于等于1 000小于10 000的菌株有10珠，占2.55%；LD50大于等于10 000的菌株有15珠，占2.55%。其中LD50大于等于1億的菌株有5珠，占1.27%，分布于共和縣、興?？h、格爾木市和都蘭縣，分離宿主為人尸體、喜馬拉雅旱獺和五趾跳鼠。青海省各地區(qū)392珠鼠疫菌對(duì)小鼠LD50結(jié)果見(jiàn)表1，LD50小于1 000的強(qiáng)毒菌有367株占測(cè)毒數(shù)量的93.62%。將測(cè)毒數(shù)據(jù)導(dǎo)入數(shù)據(jù)庫(kù)后用QHEndem ic-GIS軟件對(duì)鼠疫菌LD50小于100和小于1 000的菌株數(shù)空間分布圖見(jiàn)圖1、2。

2.2青海省鼠疫菌不同生態(tài)型毒力 青海省各地區(qū)392株鼠疫菌按照不同生態(tài)型(生態(tài)型分類(lèi)依據(jù)文獻(xiàn)[2])菌株分類(lèi)統(tǒng)計(jì)LD50結(jié)果見(jiàn)表2，將青藏高原型菌株和祁連山型菌株的LD50數(shù)據(jù)輸入SPSS21.0，用SPSS 21.0計(jì)算青藏高原型菌株LD50分布為正態(tài)分布，均數(shù)為166458.224，標(biāo)準(zhǔn)差為2626588.49；祁連山型菌株LD50分布為正態(tài)分布，均數(shù)為81.785，標(biāo)準(zhǔn)差為294.19。用SPSS 21.0做兩獨(dú)立樣本秩和檢驗(yàn)，檢驗(yàn)類(lèi)型選擇“Mann Whitney U”Z值為-1.687，P<0.01，故認(rèn)為兩種生態(tài)型菌株LD50間有顯著性差異。青海田鼠型和其他生態(tài)型菌株因抽樣比例較少未做LD50比較。

圖1LD50小于100的鼠疫菌株空間分布

Fig.1SpatialdistributionofLD50<100Yersiniapestisstrains

圖2LD50大于等于100小于1000鼠疫菌株空間分布

Fig.2Spatialdistributionof100≤LD50<1000Yersiniapestisstrains

3 討 論

鼠疫菌與其他病原微生物一樣, 不同疫源地的鼠疫菌的毒力有明顯的差異, 因此, 毒力也作為鼠疫菌分型的一個(gè)重要指標(biāo)[3]。張春華等[4]指出以往工作中鼠疫菌毒力測(cè)定中存在概念混淆，將LD100誤說(shuō)為MLD[4]，推薦更加適用的半數(shù)致死量(LD50)計(jì)算方法[4]。朱錦沁等[5]用小鼠對(duì)鼠疫菌毒力的劃分為：MLD在1萬(wàn)或l萬(wàn)以下為強(qiáng)毒菌，MLD大于1萬(wàn)小于10萬(wàn)為中等毒力菌，100億菌尚不能完全致死小白鼠的為自然弱毒菌，這是對(duì)鼠疫菌毒力最早的劃分。黃堅(jiān)華等[6]參考我國(guó)生物制品規(guī)定中鼠疫菌安全生產(chǎn)試驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)，將我國(guó)的鼠疫菌的毒力分為4種類(lèi)型，即強(qiáng)毒株、中等毒株、低毒株和弱毒株。目前關(guān)于鼠疫菌毒力的劃分還沒(méi)有統(tǒng)一的標(biāo)準(zhǔn)，應(yīng)按照LD50確定鼠疫菌的毒力劃分較為準(zhǔn)確。按照青海省392株鼠疫菌對(duì)小鼠毒力測(cè)定結(jié)果，LD50小于1 000的鼠疫菌株應(yīng)劃分為鼠疫強(qiáng)毒株，占93.62%(367/392)；LD50大于等于1 000小于10 000的鼠疫菌株為鼠疫中等毒力株，占2.55%(10/392)；LD50大于等于10 000小于1億的鼠疫菌株為鼠疫低毒株，占2.55%(10/392)；LD50大于等于1億的鼠疫菌株為弱毒株，占1.27%(5/392)。本次試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)毒力變異的弱毒株5株，有1株分離于人尸體中，1株分離于五趾跳鼠，3株分離于喜馬拉雅旱獺。王麗[7]等在青?！叭础钡貐^(qū)調(diào)查發(fā)現(xiàn)，部分在疫源地居住的居民進(jìn)入疫源地務(wù)工及捕食旱獺的人員血清存在鼠疫抗體，血清抗體滴度普遍不高。浙江、廣西、廣東、河北、陜西、青海等省市均發(fā)現(xiàn)健康人群鼠疫F1抗體陽(yáng)性情況[7-12]，本次毒力測(cè)定過(guò)程中發(fā)現(xiàn)5株鼠疫菌半數(shù)致死量大于1億，這或許應(yīng)成為健康人群血清存在鼠疫抗體的一個(gè)研究方向。不同生態(tài)類(lèi)型疫源地的菌株毒力存在明顯的差異，本次毒力測(cè)定發(fā)現(xiàn)祁連山型菌株毒力比青藏高原型菌株毒力強(qiáng)，兩者菌株LD50有顯著性差異。青海田鼠型因地區(qū)局限，分離菌株數(shù)量少，本次研究抽樣較少，未做LD50比較。

表1 青海省各地區(qū)392株鼠疫菌對(duì)小鼠LD50結(jié)果

表2 青海省各地區(qū)392株不同生態(tài)型鼠疫菌對(duì)小鼠LD50結(jié)果

從圖上可以看出，青海省鼠疫菌絕大多數(shù)屬于鼠疫強(qiáng)度株，鼠疫強(qiáng)毒株分布覆蓋了青海省大部分面積。青海省鼠疫以強(qiáng)毒株為主，鼠疫病型易由腺鼠疫轉(zhuǎn)化為肺鼠疫，應(yīng)進(jìn)一步加強(qiáng)動(dòng)物鼠疫監(jiān)測(cè)，防止人間鼠疫發(fā)生。建立青海省鼠疫自然疫源地鼠疫菌毒力基礎(chǔ)數(shù)據(jù)，可供其他學(xué)者后續(xù)研究參考。

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