李學(xué)琴，張露萍，徐燕梅，彭麗娜，孫建國(guó)，陳正堂

肺癌是當(dāng)今世界發(fā)病率、死亡率最高的惡性腫瘤，其中80%～85%為非小細(xì)胞肺癌(non-small cell lung cancer，NSCLC)。近來(lái)基于表皮生長(zhǎng)因子受體(epidermal growth factor receptor，EGFR)和K-ras基因檢測(cè)的EGFR酪氨酸激酶抑制劑(tyrosine kinase inhibitor，TKI)靶向治療為NSCLC患者帶來(lái)了新的希望[1]?，F(xiàn)已明確，K-ras基因是EGFR信號(hào)傳導(dǎo)通路中重要的下游分子，其突變與肺癌患者對(duì)TKI的原發(fā)性耐藥有關(guān)，而且97%的突變位點(diǎn)為外顯子2的12和13位密碼子[1]。因此K-ras突變是影響NSCLC患者TKI治療效果及預(yù)后的關(guān)鍵因素[2]，檢測(cè)K-ras突變是一個(gè)必要的治療抉擇。研究發(fā)現(xiàn)K-ras突變?yōu)槟[瘤特異性的體細(xì)胞遺傳改變，正常細(xì)胞中尚未發(fā)現(xiàn)[3]，但在癌癥患者的血漿中，有少量的包含突變序列的游離DNA從原發(fā)或轉(zhuǎn)移的腫瘤細(xì)胞釋放入血，但由于濃度過(guò)低，很難在大量的野生型序列中將其檢測(cè)出來(lái)，如傳統(tǒng)的Sanger測(cè)序方法需要突變體DNA至少占到野生型DNA的10%～20%[4]。因此，提高突變DNA相對(duì)濃度，抽提并富集少量突變小片段DNA是技術(shù)的關(guān)鍵。在本研究中，我們建立了一種酶切富集突變DNA后行焦磷酸測(cè)序的方法，用于檢測(cè)臨床癌組織及血漿樣本中的K-ras突變體。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 收集2013年1月－10月在重慶新橋醫(yī)院全軍腫瘤診治研究所治療的經(jīng)組織學(xué)和(或)細(xì)胞學(xué)確診的43例NSCLC患者的癌組織和外周血標(biāo)本，所有患者TNM分期均為Ⅲ-Ⅳ期。

1.2 標(biāo)本采集與DNA提取 ①患者入院后次日采集空腹外周靜脈血2ml，EDTA抗凝，2h內(nèi)分離血漿，采用QIAamp Mini Blood Kit提取血漿內(nèi)游離DNA。②包括經(jīng)皮肺穿刺和纖維支氣管鏡所取得的新鮮組織或4%甲醛浸泡或石蠟包埋的切片，采用QIAamp DNA FFPE Tissue Kit提取組織DNA，具體操作按說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。超微量紫外分光光度計(jì)測(cè)定DNA濃度，記錄編號(hào)，置于－20℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 酶切富集PCR擴(kuò)增 采用酶切富集PCR法擴(kuò)增包含12與13號(hào)密碼子在內(nèi)的K-ras基因第2外顯子。引物(表1)由上海英駿生物科技有限公司合成。

表1 酶切富集PCR擴(kuò)增引物及焦磷酸測(cè)序引物Tab.1 The primer of mutant-enriched PCR and pyrosequencing

第一輪PCR反應(yīng)體系為25μl。12密碼子的PCR擴(kuò)增條件為：94℃預(yù)變性3min；94℃變性20s、58℃退火30s、72℃延伸20s，共30個(gè)循環(huán)；72℃延伸10min。13密碼子的PCR擴(kuò)增條件為：94℃預(yù)變性3min；前10個(gè)循環(huán)為94℃變性20s、54℃退火30s、72℃延伸20s，后25個(gè)循環(huán)為94℃變性20s、60℃退火30s、72℃延伸20s，共35個(gè)循環(huán)；最后72℃延伸10min。

使用突變體特異的內(nèi)切酶Bsto Ⅰ、Nar Ⅰ選擇性地酶切第一輪PCR擴(kuò)增產(chǎn)物中K-ras第2外顯子的12、13密碼子。相應(yīng)孵育溫度下孵育4h(12、13密碼子的孵育溫度分別為60℃、37℃)。

第二輪PCR反應(yīng)體系為40μl。12、13密碼子的PCR擴(kuò)增條件為：94℃預(yù)變性3min；94℃變性20s、60℃退火30s、72℃延伸20s，共50個(gè)循環(huán)；72℃延伸10min。根據(jù)K-ras突變情況將結(jié)果分為兩組，即突變組和K-ras野生組。

1.4 焦磷酸測(cè)序 ①設(shè)定程序，分析序列為：GG/T/A/CTGG/A/C/TCGTAAGGCAAG；堿基分配序列為：TACGACTCAGATCGTAG。②在96孔PCR反應(yīng)板中加入磁珠3μl、結(jié)合緩沖液37μl、PCR產(chǎn)物40μl，室溫下1400r/min充分混勻5min。③配制含0.3μmol/L測(cè)序反應(yīng)液45μl。④開(kāi)啟真空泵吸取磁珠和PCR產(chǎn)物混懸液，依次浸入70%乙醇、0.2mol/L NaOH和洗脫緩沖液中洗滌5s、5s、10s。關(guān)閉真空泵，將探頭上吸附的磁珠釋放入測(cè)序反應(yīng)液，80℃孵育2min，使測(cè)序引物與模板退火雜交，然后室溫下冷卻10min。⑤根據(jù)程序計(jì)算得出劑量，在試劑倉(cāng)中依次加入底物混合物、酶混合物以及4種dNTP，將試劑倉(cāng)和96孔測(cè)序反應(yīng)板放入機(jī)箱中開(kāi)始反應(yīng)[5]。

1.5 靈敏度鑒定 將K-ras基因突變型(12密碼子)的A549細(xì)胞與K-ras基因野生型的HCC827細(xì)胞提取基因組DNA，使其中突變型與野生型K-ras基因的比例分別為1:0、0:1、1:1、1:10、1:100、1:1000、1:5000。按上述檢測(cè)12密碼子突變的方法進(jìn)行檢測(cè)。

2 結(jié) 果

2.1 焦磷酸測(cè)序檢測(cè)突變結(jié)果 43例癌組織中檢測(cè)出4例突變，突變率為9.3%(4/43)，外周血樣本中檢測(cè)出3例突變，突變率為7.0%(3/43)。以癌組織中檢測(cè)到的K-ras為標(biāo)準(zhǔn)，兩者突變一致性達(dá)75.0%(3/4，表2)。兩種標(biāo)本同時(shí)存在突變的有3例，均為12密碼子突變；A1、A2，D1、D2突變類型為GGT→AGT；B1，C1、C2突變類型為GGT→GAT；B2為野生型(圖1)。

表2 NSCLC患者外周血和癌組織K-ras突變一致性Tab.2 Consistency of K-ras mutation from NSCLC patients'plasma and matched cancer tissue

2.2 靈敏度測(cè)試結(jié)果 K-ras突變型與野生型細(xì)胞分別按1:0、0:1、1:1、1:10、1:100、1:1000、1:5000比例混合(圖2)，當(dāng)突變型與野生型K-ras基因比例大于1:1000時(shí)(0.1%)時(shí)，即可見(jiàn)到突變的峰，表明檢測(cè)閾值為0.1%(突變型/野生型基因)。

3 討 論

ras基因家族中與人類腫瘤相關(guān)的基因有3種，即H-ras、K-ras、N-ras，其中K-ras與人類癌癥關(guān)系最為密切，該基因位于人類染色體12p12.1，其編碼的ras蛋白是細(xì)胞外信號(hào)向胞內(nèi)傳導(dǎo)的信號(hào)通路網(wǎng)絡(luò)中的主要蛋白之一，可作為分子開(kāi)關(guān)參與細(xì)胞增殖、分化、凋亡的調(diào)控。K-ras基因突變會(huì)導(dǎo)致ras蛋白異?；罨?，持續(xù)激活ras-raf-MEK等信號(hào)通路，導(dǎo)致細(xì)胞異常增生，促進(jìn)腫瘤形成[6]。NSCLC患者K-ras突變主要發(fā)生于第2外顯子的12、13密碼子，其中12密碼子的突變占87%，13密碼子的突變占12%；第3外顯子的61和146密碼子的突變發(fā)生率低，只占K-ras突變的1%～4%。因此12、13密碼子的基因突變狀態(tài)越來(lái)越受到研究者們的重視。

圖1 NSCLC患者外周血和癌組織K-ras突變焦磷酸測(cè)序檢測(cè)結(jié)果Fig.1 K-ras mutations of NSCLC patients detected by pyrosequencing1. K-ras mutation in cancer tissue; 2. K-ras mutation in plasma. The black arrow showed the point mutation G→A in codon 12

圖2 改良的酶切富集PCR-焦磷酸測(cè)序技術(shù)靈敏度測(cè)試結(jié)果Fig.2 The sensitivity of the modified mutant-enriched PCR combined with pyrosequencing The ratio of mutation type/wild type was 1:0(A), 0:1(B), 1:1(C), 1:10(D), 1:100(E), 1:1000(F) and 1:5000(G)

以往認(rèn)為K-ras基因突變常常發(fā)生在腫瘤惡變的早期，原發(fā)灶和轉(zhuǎn)移灶的K-ras基因保持高度一致[7]，且K-ras基因狀態(tài)不會(huì)因治療而發(fā)生變化[8]。然而目前已證實(shí)K-ras基因狀態(tài)在轉(zhuǎn)移進(jìn)展過(guò)程中并不總是穩(wěn)定的，在NSCLC患者的整個(gè)病程中，腫瘤細(xì)胞不斷增殖分化，K-ras基因可能在轉(zhuǎn)移過(guò)程中發(fā)生改變[9]。K-ras基因的轉(zhuǎn)換狀態(tài)可能是原發(fā)灶陰性而轉(zhuǎn)移灶陽(yáng)性，也可能原發(fā)灶陽(yáng)性而轉(zhuǎn)移灶陰性。即使只在一小部分細(xì)胞中檢測(cè)到K-ras基因突變，仍然會(huì)給TKI治療帶來(lái)阻力。因此在同一患者不同時(shí)期，腫瘤對(duì)靶向治療的適應(yīng)性可能會(huì)有明顯不同，建議在治療過(guò)程中動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)K-ras基因突變狀況。

目前一般采用腫瘤組織DNA進(jìn)行突變檢測(cè)，常通過(guò)經(jīng)皮肺穿刺、手術(shù)、纖維支氣管鏡等途徑獲得，但若動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)組織來(lái)源的腫瘤細(xì)胞DNA突變狀況，獲取組織時(shí)創(chuàng)傷大，患者難以接受，對(duì)外周血進(jìn)行檢測(cè)具有創(chuàng)傷小、取材方便、可動(dòng)態(tài)隨訪等特點(diǎn)，患者易于接受，但外周血中游離DNA量少，擴(kuò)增少量突變DNA是技術(shù)上的關(guān)鍵。眾多學(xué)者為解決這一難題，在PCR法的基礎(chǔ)上探索出酶切富集PCR法，通過(guò)PCR擴(kuò)增野生型或突變型DNA，限制性酶消化野生型基因，經(jīng)消化后突變的比例相對(duì)于野生型DNA顯著增加，然后再行第二輪PCR擴(kuò)增突變的DNA序列。Maluf-Filho等[10]采用酶切富集PCR聯(lián)合限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性方法檢測(cè)57例胰腺癌患者的癌組織，結(jié)果顯示K-ras突變率為66.7%；Wu等[11]采用酶切富集PCR聯(lián)合液態(tài)芯片分析技術(shù)檢測(cè)109例非小細(xì)胞肺癌患者血清，結(jié)果顯示K-ras基因突變率為31.2%；Yang等[12]采用酶切富集聯(lián)合變性高效液相分析技術(shù)檢測(cè)120例結(jié)直腸癌患者血漿，結(jié)果顯示K-ras基因總突變率為38.3%。但這些方法分別需要應(yīng)用電泳、設(shè)計(jì)鍍探針的磁珠等，成本高、操作繁瑣、結(jié)果主觀性強(qiáng)?；谏鲜隹紤]，本研究探索了在酶切富集PCR的基礎(chǔ)上，聯(lián)合焦磷酸測(cè)序技術(shù)對(duì)PCR產(chǎn)物的突變類型進(jìn)行分析。焦磷酸測(cè)序是一種新的DNA序列分析技術(shù)，其特點(diǎn)是操作簡(jiǎn)便、高通量、自動(dòng)化，適合大樣本的快速檢測(cè)，但缺點(diǎn)為需已知突變位點(diǎn)，據(jù)突變位點(diǎn)選擇特異的限制性內(nèi)切酶。

本研究中，癌組織中K-ras基因突變率為9.3%，與文獻(xiàn)報(bào)道的肺癌K-ras突變率10%～30%相比稍偏低[12]，考慮可能是樣本量相對(duì)較少所致。本研究的43例癌組織樣本中，4例為12密碼子突變，突變類型為GAT、AGT；外周血樣本中，3例為12密碼子突變，突變類型與癌組織一致，1例經(jīng)重復(fù)檢測(cè)仍未檢測(cè)到突變，原因可能為：①癌細(xì)胞在轉(zhuǎn)移過(guò)程中丟失了某種K-ras基因型；②癌細(xì)胞群中存在廣泛的表觀遺傳學(xué)及細(xì)胞遺傳學(xué)，或是具有特定的器官轉(zhuǎn)移親嗜性[13]。本實(shí)驗(yàn)的靈敏度為0.1%，是直接測(cè)序法的100倍。本技術(shù)更適合臨床檢測(cè)血漿和組織樣本中少量突變的K-ras基因，可用于活檢和循環(huán)腫瘤細(xì)胞樣本的檢測(cè)。

[1] Forbes S, Clements J, Dawson E, et al. COSMIC 2005[J]. Br J Cancer, 2006, 94 (2): 318-322.

[2] Massarelli E, Varella-Garcia M, Tang X, et al. KRAS mutation is an important predictor of resistance to therapy with epidermal growt factor receptor tyrosine kinase inhibitors in non-smallcell lung cancer[J]. Clin Cancer Res, 2007, 13 (10): 2890-2896.

[3] Dong Q, Huang J, Zhou Y, et al. Hematogenous dissemination of lung cancer cells during surgery: quantitative detection by flow cytometryand prognostic significance[J]. Lung Cancer, 2002, 37(3): 293-301.

[4] Moskalev EA, St?hr R, Rieker R, et al. Increased detection rates of EGFR and KRAS mutations in NSCLC specimens with low tumour cell content by 454 deep sequencing[J]. Virchows Arch,2013, 462 (4): 409-419.

[5] Sun J, Ming H, Sun JG, et al. KRAS mutation detection by pyrosequencing in plasmaof 63 patients with advanced NSCLC[J]. Chongqing Med, 2012, 41 (11): 1062-1064. [孫潔,明華,孫建國(guó), 等. 焦磷酸測(cè)序技術(shù)檢測(cè)63例晚期NSCLC患者血漿KRAS基因突變[J]. 重慶醫(yī)學(xué), 2012, 41 (11): 1062-1064.]

[6] Siddiqui AD, Piperdi B. KRAS mutation in colon cancer: a marker of resistance to EGFR-I therapy[J]. Ann Surg Oncol,2010, 17 (4): 1168-1176.

[7] Lee JC, Wang ST, Lai MD, et al. K-ras gene mutation is a useful predictor of the survival of earl stage colorectal cancers[J].Anticancer Res, 1996, 16 (6B): 3839-3844.

[8] Jimeno A, Messersmith WA, Hirsch FR, et al. KRAS mutations and sensitivity to epidermal growth factor receptor inhibitors in colorectal cancer: practical application of patient selection[J]. J Clin Oncol, 2009, 27 (7): 1130-1136.

[9] Cortot AB, Italiano A, Burel-Vandenbos F, et al. KRAS mutation status in primary nonsmall cell lungcancer and matched metastases[J]. Cancer, 2010, 116(11): 2682-2687.

[10] Maluf-Filho F, Kumar A, Gerhardt R, et al. Kras mutation analysis of fine needle aspirate under EUS guidance facilitates risk stratification of patients with pancreatic mass[J]. J Clin Gastroenterol, 2007, 41(10): 906-910.

[11] Wu S, Zhu Z, He J, et al. A novel mutant-enriched liquidchip technology for the qualitative detectionof somatic mutations in KRAS gene from both serum and tissue samples[J]. Clin Chem Lab Med, 2010, 48(8): 1103-1106.

[12] Yang Z, Long MJ, Wang F, et al. Detection and clinical significance of EGFR and KRAS mutation in peripheral blood from tumor patients by REDE-DHPLC[J]. Chin J Lab Med,2011, 34(4): 327-332. [楊卓, 龍美娟, 王斐, 等. 酶切富集聯(lián)合DHPLC檢測(cè)腫瘤患者外周血EGFR和KRAS基因突變及其臨床應(yīng)用[J]. 中華檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)雜志, 2011, 34(4): 327-332.]

[13] Gerlinger M, Rowan AJ, Horswell S, et al. Intratumor heterogeneity and branched evolution revealed by multiregion sequencing[J]. N Engl J Med, 2012, 366 (10): 883-892.