劉會珍， 陸兔林,2* ， 毛春芹， 季 德,2， 李 林， 王若衡

(1. 南京中醫(yī)藥大學藥學院，江蘇 南京 210023；2.南京中醫(yī)藥大學 江蘇省中藥炮制重點實驗室，江蘇 南京 210023)

莪術為姜科植物蓬莪術CurcumaphaeocaulisValeton、廣西莪術CurcumakwangsiensisS.G.Lee etl.F.Liang或溫郁金CurcumawenyujinY·H·Chen et C·Ling的干燥根莖[1]，具有破氣行血、消積止痛的功效和抗癌、抗病毒、抗炎、抗凝血、抗氧化和保肝等生理作用。臨床常用飲片有生莪術、醋炙莪術和醋煮莪術，生莪術行氣消積力強，醋制后主入肝經血分，增強散瘀止痛作用，療效顯著[2-3]。莪術中的主要活性成分包括以莪術二酮、吉馬酮等為代表的倍半萜類成分[4-8]，以及姜黃素、脫甲氧基姜黃素和雙脫甲氧基姜黃素為代表的姜黃素類成分(結構見圖1)。根據文獻報道莪術中的倍半萜類具有抗病毒和抗腫瘤活性[9]。藥理研究表明莪術二酮具有顯著抗凝血和抗血栓形成作用[10]，是莪術中的主要活性成分；吉馬酮(牻牛兒酮)性質穩(wěn)定，且具有抗腫瘤等方面的活性[11]，是《中國藥典》2010年版中莪術薄層鑒別的指標性成分。同時莪術中的姜黃素類成分也具有抗癌、抗早孕、抗凝血、抗氧化和保肝等廣泛的藥理活性[12-13], 且毒性低。因此，僅以倍半萜類成分或姜黃素類成分作為莪術測定的指標是不完善的，本實驗建立了HPLC-DAD法同時測定莪術不同炮制品中的倍半萜及姜黃素類成分，并比較醋制前后這兩大類活性成分的變化，對揭示中藥炮制內涵，制定醋莪術加工炮制規(guī)范和飲片質量標準具有重大意義。

圖1 莪術中倍半萜及姜黃素類成分的化學結構

1 儀器與材料

Agilent1200型高效液相色譜儀(包括在線脫氣系統(tǒng)、雙元梯度泵、自動進樣器、柱溫箱、二極管陣列檢測器)，KQ-500E型醫(yī)用超聲清洗器(昆山超聲儀器有限公司)，Mettler AG285電子分析天平(瑞士梅特勒-托利多集團)，FA1104型電子分析天平(上海精密科學儀器有限公司)，數顯恒溫水浴鍋HH-4(國華電器有限公司)。Milli-Q超純水，乙腈為色譜純，甲酸(分析純，南京試劑廠)。甲醇(分析純，上海凌峰化學試劑有限公司)。

莪術二酮(批號13657-68-6，上海滬云醫(yī)藥開發(fā)有限公司)；吉馬酮對照品(中國食品藥品檢定研究院，批號111665-200902)；雙去甲氧基姜黃素、去甲氧基姜黃素(南京澤朗醫(yī)藥科技有限公司，供含量測定用)；姜黃素( 中國食品藥品檢定研究院，批號110823-200603)。

莪術藥材購自安徽豐原銅陵中藥飲片有限公司，均來源于其主產地(浙江、廣西、四川)，經南京中醫(yī)藥大學藥學院巢建國教授鑒定，分別為姜科植物溫郁金CurcumawenyujinY.H.Chen et C.Ling、廣西莪術CurcumakwangsiensisS.G.Lee et C.F.Liang及蓬莪術CurcumaphaeocaulisVal.的干燥根莖。

根據《中國藥典》2010年版莪術飲片制法項下制得生莪術飲片、醋制莪術飲片和醋煮莪術飲片。樣品來源及品種見表1。

表1 樣品來源及鑒定結果

2 方法與結果

2.1 樣品的制備

2.1.1 生飲片 取原藥材, 大小分檔, 洗凈, 剪去須根,蒸制透心，趁熱切薄片, 干燥, 篩去碎屑作為生品(飲片)。

2.1.2 醋炙飲片 取生品(飲片), 加定量米醋拌勻,稍悶潤, 待醋汁被吸盡后, 置炒制容器內, 用文火加熱,炒至微黃色, 略帶焦斑時, 取出, 放涼。每100 kg莪術用米醋20 kg。

2.1.3 醋煮飲片 取原藥材置煮制容器內, 加米醋及適量水浸沒, 用文火煮至醋汁被吸盡, 內無白心時,取出, 稍晾, 切薄片, 干燥。每100 kg莪術用米醋20 kg。

2.2 色譜條件 Hanbon ODS-2 C18色譜柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)，流動相為0.05%甲酸乙腈(A)-0.05%甲酸水(B)，梯度洗脫(0～20 min，45%～55% A；20～40 min，55%～75%A;40～50 min，75%～90%A；50～65 min，90%～100%A)，下一個循環(huán)前用45%的乙腈平衡10 min；體積流量1 mL/min；柱溫30 ℃，檢測波長216 nm和430 nm，進樣量20 μL。色譜圖見圖2。

圖2 對照品(A)及莪術飲片(B)、醋炙飲片(C)和醋煮飲片(D)的高效液相色譜圖

2.3 溶液的配制

2.3.1 對照品溶液的制備 精密稱取莪術二酮、吉馬酮、姜黃素、去甲氧基姜黃素和雙去甲氧基姜黃素對照品適量，加甲醇分別制成單個對照品貯備液。分別精密取各貯備液適量，配制成混合對照品貯備液，以上5個化合物在混合對照品貯備液中的質量濃度分別為0.167 4、 0.040 6、0.017 3、0.019 3、0.001 1 mg/mL。

2.3.2 供試品溶液的制備 莪術飲片粉碎過三號篩(50目)，取粉末0.5 g，精密稱定，加50 mL 90%乙醇，索氏回流提取至提取溶劑無色，50 ℃水浴揮干溶劑，殘渣加甲醇溶解，定容至5 mL，搖勻，過微孔濾膜(0.45 μm)，20 μL進樣。

2.4 線性關系考察 精密吸取上述混合對照品溶液 1、6、10、16、20 μL進樣分析，每個體積進樣2次，按“2.2”項下色譜條件測定峰面積，以峰面積平均值對質量濃度進行線性回歸，得回歸方程分別為：莪術二酮y=478.82x+0.162 8，r=1.000 0；吉馬酮y=2 049.8x-3.217 8，r=1.000 0；雙去甲氧基姜黃素y=4 890.7x-2.220 4，r=1.000 0；去甲氧基姜黃素y=5 301.1x-5.724 4，r=1.000 0；姜黃素y=4 660.8x-5.571，r=1.000 0；結果表明莪術二酮在8.37～167.5 μg/mL、吉馬酮在2.03～40.59 μg/mL、雙去甲氧基姜黃素在0.23～1.14 μg/mL、去甲氧基姜黃素在0.99～19.8 μg/mL、姜黃素在0.89～17.8 μg/mL線性關系良好。

2.5 精密度試驗 取上述混合對照品溶液，于同一天內連續(xù)進樣6次，每次進樣10 μL，測定莪術二酮、吉馬酮、雙去甲氧基姜黃素、去甲氧基姜黃素、姜黃素的峰面積值，計算得其RSD值，分別為0.74%、1.22%、1.56%、1.12%和0.68%。

2.6 穩(wěn)定性試驗 精密吸取同一供試品溶液20 μL分別于制備后0、6、12、 24、 48 h進樣，測定莪術二酮、吉馬酮、雙去甲氧基姜黃素、去甲氧基姜黃素、姜黃素的峰面積，RSD值分別為1.72%、0.62%、2.47%、1.34%、1.33%。表明供試品溶液在48 h內穩(wěn)定。

2.7 重復性試驗 稱取莪術粉末(批號120506)約0.5 g，共6份，精密稱定，按“2.3.2”項下制備樣品，測定莪術二酮、吉馬酮、雙去甲氧基姜黃素、去甲氧基姜黃素、姜黃素的平均含有量為0.377 6、0.300 6、0.006 5、0.1219、0.129 4 mg/g，RSD值分別為4.2%、6.5%、1.5%、1.4%、1.5%。

2.8 準確度試驗 精密稱取已知5個成分含有量的莪術粉末(批號120506)約0.25 g，共9份。根據樣品中各成分量的80%、100%與120%，分別加入對照品溶液各3份，按“2.3.2”項下方法制備成供試品溶液，按上述色譜條件進行HPLC分析，根據測得量和加入量計算回收率。結果莪術二酮、吉馬酮、雙去甲氧基姜黃素、去甲氧基姜黃素、姜黃素的加樣回收率分別為103.4%、100.1%、98.3%、96.8%、100.5%，RSD值分別為0.3%、1.1%、1.9%、1.3%、2.2%。

2.9 樣品測定 取各批次莪術生飲片、醋炙飲片和醋煮飲片樣品，按“2.3.2”項下方法制備供試品溶液，每份樣品平行3份，按上述色譜條件測定，計算5種成分的平均質量分數，結果見表2。

表2 莪術不同炮制品中倍半萜和姜黃素類成分的測定(n=3)

與相應生品相比，醋炙飲片和醋煮飲片中這5個活性成分的量均有不同程度的下降，樣品CIK110522中雙去甲氧基姜黃素的量較其相應生品CK110522有所升高,與整體變化趨勢稍有差異。

3 討論

3.1 色譜條件的優(yōu)化 鑒于待測樣品中包含兩種不同類型的成分，本實驗首先考察了兩種不同的流動相系統(tǒng)(甲醇-水和乙腈-水)進行梯度洗脫，結果甲醇-水系統(tǒng)梯度洗脫無法使倍半萜類和姜黃素類成分分離，且峰形不好；乙腈-水系統(tǒng)可以使倍半萜類(莪術二酮、吉馬酮)分離，但無法使姜黃素類成分分離良好；查閱文獻后，在乙腈和水中分別加酸以使姜黃素類成分達到基線分離，分別考察了不同種類的酸和加入酸的比例，結果0.05%甲酸乙腈-0.05%甲酸水系統(tǒng)梯度洗脫，可以使姜黃素類成分達到基線分離并不對倍半萜類(莪術二酮、吉馬酮)產生影響。同時對樣品進行全波長掃描，最終確定莪術二酮、吉馬酮的檢測波長為216 nm，姜黃素類成分的檢測波長為430 nm。

3.2 供試品溶液的制備 在供試品溶液的制備過程中，考察了不同的提取溶劑(乙醚、甲醇、無水乙醇和90%乙醇)和不同的提取方法(超聲提取和索氏回流提取)，結果發(fā)現90%乙醇索氏回流提取至提取溶劑無色，提取效果較好，這兩類成分均能得到最佳提取且色譜峰峰形較好。

3.3 小結 醋炙莪術飲片、醋煮莪術飲片中莪術醇、吉馬酮和姜黃素類化合物的量均低于生莪術飲片。莪術二酮和吉馬酮為倍半萜類化合物，熔沸點較低，醋炙與醋煮過程中加熱易造成這些成分的揮發(fā)，故炮制后含有量降低。此外，莪術二酮在加熱條件下發(fā)生熱重排反應轉化成莪術醇[14]，但相同條件下莪術醇不能轉化成莪術二酮，可能是莪術二酮炮制后含有量降低的原因之一。姜黃素類性質不穩(wěn)定，在加熱和酸性條件下可能發(fā)生降解而導致含有量降低，降解過程及規(guī)律有待進一步研究。

此外， 批號CIK110522樣品中雙去甲氧基姜黃素的變化趨勢出現差異，其原因可能是炮制過程中，人為因素的影響，如潤制時間、炒制時間、炒制程度、煮法的加水量和煮制時間的掌握等，可能會影響測定結果，制定規(guī)范化、標準化的炮制操作規(guī)程尤為必要。本研究為制定莪術炮制規(guī)范及飲片質量標準提供了參考。

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