孫強(qiáng)，楊麗麗

（黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)，大慶 163319）

自從20世紀(jì)40年代化學(xué)殺蟲劑廣泛應(yīng)用以來，化學(xué)防治逐漸成為蚊蟲防治的主要方法，但是長(zhǎng)期大量的使用化學(xué)殺蟲劑，不僅對(duì)環(huán)境造成了嚴(yán)重的污染，給人類的生活、健康帶來了嚴(yán)重的傷害，蚊蟲抗藥性也隨之出現(xiàn)，其案例在世界各地大量報(bào)道。為此，人們更加關(guān)注生物防治，期望找到一條對(duì)環(huán)境無污染，又可高效滅蚊的防治途徑。在已有的生物防治中，主要包括病原微生物滅蚊、捕食性天敵滅蚊和轉(zhuǎn)基因工程藍(lán)藻防治蚊蟲，其中，在應(yīng)用病原細(xì)菌滅蚊方面研究較多。20世紀(jì)60年代，各國(guó)學(xué)者分離篩選了多種可用于蚊蟲防治的微生物，其中研究最為深入的是球形芽孢桿菌（Bacillus sphaericus，Bs）和蘇云金芽孢桿菌以色列亞種（Bacillus thuringiensis israelensis，Bti）[1]。蘇云金芽孢桿菌具多種類型的殺蟲晶體蛋白，具有殺蟲特異性強(qiáng)，對(duì)人、畜及非目標(biāo)昆蟲無毒副作用，安全性好，不污染環(huán)境[1]。球形芽孢桿菌是一種在自然界中廣泛分布、形成亞末端膨大孢子囊和球形芽孢的好氣芽孢桿菌。但是由于這兩種微生物產(chǎn)生的毒素不同，作用方式不同，其滅蚊的范圍也不相同。因此，對(duì)近年來球形芽孢桿菌Mtx1毒蛋白和蘇云金芽孢桿菌Cry4Ba毒蛋白基因工程研究進(jìn)展進(jìn)行綜述。

1 球形芽孢桿菌Mtx1研究

球形芽胞桿菌是革蘭氏陽(yáng)性菌，廣泛的分布在自然界中。球形芽孢桿菌在營(yíng)養(yǎng)期可以產(chǎn)生Mtx毒蛋白，Mtx毒蛋白存在于低毒力和部分高毒力菌株中[2]。已報(bào)道的有3種類型的Mtx蛋白：Mtx1、Mtx2和Mtx3。Mtx1毒蛋白是一種分子量為100 kDa的可溶性毒素，由870個(gè)氨基酸組成。它的N-末端有一個(gè)具有G-細(xì)菌信號(hào)肽特征的序列[3]。

1.1 Mtx1簡(jiǎn)介

1989年Thanabula等[4]發(fā)現(xiàn)Mtx1殺蚊毒蛋白對(duì)蚊幼蟲具有高毒力，純化后的Mtx1殺蚊毒蛋白同Bin晶體毒素的殺蚊活性相當(dāng)。1993年Thanabula等[5]通過研究發(fā)現(xiàn)Mtx1毒蛋白在中腸胰蛋白酶的作用下可以分解為分子量為27 kDa和70 kDa的2個(gè)片段，并認(rèn)為它們分別來自于Mtxl毒蛋白的N-末端和C-末端，N-末端能使蚊幼蟲中腸細(xì)胞內(nèi)的ADP核糖基部分與蛋白質(zhì)的氨基酸殘基發(fā)生連接反應(yīng)，從而使蛋白質(zhì)失去功能。C-末端能引起離體培養(yǎng)的蚊蟲細(xì)胞發(fā)生病變，然而，只有當(dāng)2個(gè)片段同時(shí)存在時(shí)才對(duì)蚊幼蟲有毒殺作用。1995年Thanabula等[6]通過對(duì)球形芽孢桿菌9種不同株系的研究發(fā)現(xiàn)，這9種株系孢子細(xì)胞中的Mtx1毒蛋白表達(dá)非常低，以致無法檢測(cè)出。其中5種株系在營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)期能夠產(chǎn)生Mtxl毒蛋白，而研究來源于6個(gè)DNA同源組的球形芽孢桿菌發(fā)現(xiàn)：球形芽孢桿菌可以產(chǎn)生蛋白酶。為了確定該蛋白酶的作用，將Mtx1毒蛋白基因通過使用原始啟動(dòng)子表達(dá)在球形芽孢桿菌1693（蛋白酶陰性）多拷貝質(zhì)粒和球形芽孢桿菌13052（蛋白酶陽(yáng)性）中。球形芽孢桿菌1693不產(chǎn)生蛋白酶，它的營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)細(xì)胞和孢子細(xì)胞均有高水平的Mtx1，而球形芽孢桿菌13052產(chǎn)生蛋白酶，它的Mtx1含量非常低。從而證明該蛋白酶可以降解孢子中的Mtx1毒蛋白。

1.2 Mtx1基因工程研究

作為微生物殺蟲劑的球形芽孢桿菌和蘇云金芽孢桿菌同樣也面臨著靶標(biāo)害蟲產(chǎn)生抗藥性問題，但蘇云金芽孢桿菌的壓力較小，因?yàn)樘K云金芽孢桿菌伴孢晶體中包括多種毒蛋白，多種混合的毒蛋白能夠延緩抗藥性的產(chǎn)生與發(fā)展；球形芽孢桿菌則易使靶標(biāo)害蟲產(chǎn)生抗藥性，主要是由于是單因子遺傳抗性，這方面資料在法國(guó)、印度、巴西、中國(guó)等世界各地已有大量的案例報(bào)道。如何防止靶標(biāo)害蟲產(chǎn)生抗藥性是當(dāng)前研究熱點(diǎn)內(nèi)容之一，傳統(tǒng)抗藥性管理策略包括輪換和混合使用蘇云金芽孢桿菌與球形芽孢桿菌，而新策略包括基因工程增加殺蚊幼毒素的多樣性和增加殺蚊產(chǎn)品的種類，避免殺蟲劑抗藥性的產(chǎn)生[7]。2003年Boonhiang Promdonkoy等[8]將來自球形芽孢桿菌2297中的Mtx1殺蚊基因在大腸桿菌中克隆表達(dá)，分析克隆的DNA序列是由870個(gè)氨基酸構(gòu)成，但Mtx1殺蚊基因在大腸桿菌中表達(dá)非常低，或者表達(dá)的是融合蛋白。在敲除假定先導(dǎo)序列后，蛋白表達(dá)水平提高，敲除后的基因表達(dá)的是谷胱甘肽MTX融合蛋白GST-tMtx1，GST-tMtx1對(duì)致倦庫(kù)蚊Culex quinquefasciatus幼蟲具有高毒，但是對(duì)大劣按蚊（Anopheles dirus）和埃及伊蚊（Aedes aegypti）幼蟲低毒。2003年張蓓華等[9]將來源于球形芽孢桿菌SSII-1的Mtx1毒素基因克隆至穿梭載體PBU4上，得到Mtx1插入方向相反的重組質(zhì)粒PMT19和PMT4，發(fā)現(xiàn)含有重組質(zhì)粒PMT19和PMT4的蘇云金芽孢桿菌轉(zhuǎn)化子B-PMT19和B-PMT4在營(yíng)養(yǎng)體生長(zhǎng)階段對(duì)敏感蚊幼和抗性幼蟲也具有毒性，毒力與野生型SSII-1相當(dāng)。2007年楊艷坤等人[10]采用常規(guī)生物測(cè)定法確定了純化的球形芽孢桿菌缺失信號(hào)肽的97 kDa營(yíng)養(yǎng)期Mtx1毒蛋白和蘇云金芽孢桿菌27.3 kDa的Cry1Aa晶體蛋白對(duì)致倦庫(kù)蚊幼蟲的殺蟲活性，結(jié)果表明：Mtx1和Cry1Aa不同比列的混合物對(duì)致倦庫(kù)蚊的毒力比單獨(dú)毒素蛋白高，2種毒蛋白對(duì)目標(biāo)蚊幼蟲具有協(xié)同毒殺作用，在LC98處理濃度下，Mtx1和Cry1Aa按3∶1混合的混合物L(fēng)T50值比單獨(dú)使用Mtx1提前了6.36 h，提高了對(duì)目標(biāo)蚊蟲的毒力并縮短半致死時(shí)間。2009年Ampron Rungrod等[11]將球形芽孢桿菌Mtx1和Mtx2基因克隆到質(zhì)粒上，并轉(zhuǎn)入大腸桿菌中使其表達(dá)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)Mtx1和Mtx2具有協(xié)同毒殺作用，同時(shí)表達(dá)Mtx1和Mtx2的大腸桿菌對(duì)埃及伊蚊幼蟲的毒力是單獨(dú)表達(dá)其中一種毒素的大腸桿菌的10倍。

2 Cry4Ba研究

蘇云金芽孢桿菌在形成芽孢的過程中，能夠產(chǎn)生多種蛋白，這些蛋白具有特異的殺蟲活性，所以又被稱為殺蟲晶體蛋白。目前，已發(fā)現(xiàn)30多種Bt亞種或血清型對(duì)不同種類的蚊蟲具有殺蟲活性[12]。具有殺蚊活性的蛋白主要有兩類，一類為特殊的內(nèi)毒素即溶細(xì)胞毒素，另一類為通常的內(nèi)毒素晶體蛋白。前者主要包括CytlA，Cyt2Ba，Cyt2Bb和Cyt2Bc，后者主要是 Cry2Aa，Cry4A，Cry4B，Cryl0A，CryllA，CryllBa，CryllBb，Cryl9A，Cryl9B，Cry20Aa和Cry27A[13]。

2.1 Cry4Ba作用機(jī)理和結(jié)構(gòu)

Cry4Ba 是從蘇云金球形芽孢桿菌以色列亞種中分離獲得，對(duì)伊蚊和按蚊的幼蟲具有較好的毒殺作用。Cry4Ba合成形式為二元毒素，分子量為130 kDa。Cry蛋白殺蟲的主要過程為：伴孢晶體在昆蟲幼蟲中腸中由于堿性消化液的作用而溶解，釋放原毒素蛋白。原毒素在中腸蛋白酶作用下進(jìn)一步降解為活性毒蛋白。昆蟲中腸刷狀緣膜囊泡細(xì)胞膜表面受體與毒蛋白結(jié)合，毒蛋白寡聚化并插入中腸細(xì)胞膜形成離子通道或孔，敏感細(xì)胞的滲透平衡被破壞，導(dǎo)致腸道細(xì)胞發(fā)生腫脹與自溶。最終導(dǎo)致蚊蟲死亡[14-15]。

Cry晶體蛋白在三維結(jié)構(gòu)上有很大的相似性，都是由3個(gè)結(jié)構(gòu)域組成。2005年Boonserm等[17]測(cè)得了Cry4Ba晶體結(jié)構(gòu)。Cry4Ba的domain I大約由298個(gè)氨基酸構(gòu)成，負(fù)責(zé)離子通道的形成，Cry4Ba的domain I是由兩性的α3～α7 5個(gè)螺旋構(gòu)成的螺旋束，α5的疏水性最強(qiáng)。α3，α4，α6和α7圍繞α5逆時(shí)針方向排列，N端的α1～α2b由于晶體形成過程中的水解作用而缺失，α1～α2b這3個(gè)螺旋對(duì)于Cry4Ba的毒力沒有明顯的作用。Cry毒素的domainⅡ大約是由205個(gè)氨基酸構(gòu)成，是受體結(jié)合位點(diǎn)，同時(shí)是Cry毒素殺蚊專一性和受體特異性結(jié)合的關(guān)鍵因素。Cry4Ba的domainⅡ是由3個(gè)反向平行的β折疊片構(gòu)成，其中2個(gè)β折疊片形成希臘鑰匙拓補(bǔ)結(jié)構(gòu)，另外一個(gè)β折疊片與螺旋結(jié)構(gòu)形成第二個(gè)希臘鑰匙拓補(bǔ)結(jié)構(gòu)。domainⅡ頂端有3個(gè)loops結(jié)構(gòu)，loop1大約由3個(gè)氨基酸構(gòu)成，loop2大約由4個(gè)氨基酸構(gòu)成，loop3大約由16個(gè)氨基酸構(gòu)成。這3個(gè)loops結(jié)構(gòu)形成一個(gè)類似于免疫球蛋白的抗原決定區(qū)。Cry4Ba的loops結(jié)構(gòu)決定了其對(duì)庫(kù)蚊的毒力。loop結(jié)構(gòu)在決定殺蚊特異性方面起一定的作用。domain III是由β折疊片構(gòu)成的三明治結(jié)構(gòu)，三明治結(jié)構(gòu)包含一個(gè)從C-末端β23鏈延伸的螺旋結(jié)構(gòu)。Cry4Ba的結(jié)構(gòu)和Cry1Aa的結(jié)構(gòu)十分相似[16-17]。

2.2 Cry4Ba基因工程研究

2001年孫釩等[18]將Cry4Aa、Cry4Ba和Cry11Aa基因轉(zhuǎn)入蘇云金芽孢桿菌無晶體突變株4Q7中，Cry4Aa、Cry4Ba和Cry11Aa基因成功表達(dá)，轉(zhuǎn)化菌株產(chǎn)生伴孢晶體。轉(zhuǎn)化菌株對(duì)敏感、抗性致倦庫(kù)蚊和白紋伊蚊（Aedes albopictus）幼蟲的生物測(cè)定結(jié)果顯示：Cry4Aa、Cry4Ba和Cry11Aa毒蛋白對(duì)庫(kù)蚊和伊蚊的毒力較低，二元毒素抗性庫(kù)蚊幼蟲對(duì)蘇云金芽孢桿菌殺蚊毒素蛋白無明顯的交叉抗性。同年孫釩等[19]將Cry4Ba與二元毒素克隆在穿梭載體上，并將其轉(zhuǎn)入蘇云金芽孢桿菌無晶體突變株中，轉(zhuǎn)化菌株Bt-BW611成功表達(dá)Cry4Ba毒蛋白與二元毒素，研究發(fā)現(xiàn)Cry4Ba毒蛋白與二元毒素具有協(xié)同作用，表達(dá)Cry4Ba與二元毒素的菌株其毒力是只表達(dá)一種毒素菌株毒力的40倍。2003年Abdullah等[20]將Cry4Ba domain II的3個(gè)loop結(jié)構(gòu)的氨基酸替換，檢測(cè)突變體蛋白對(duì)埃及伊蚊、四斑按蚊（Anopheles quadrimaculatus）、致倦庫(kù)蚊、尖音庫(kù)蚊（Culex pipiens）4種蚊蟲的毒力。loop1和loop2突變后，Cry4Ba對(duì)埃及伊蚊和四斑按蚊沒有活性；loop3突變后，Cry4Ba毒蛋白對(duì)致倦庫(kù)蚊和尖音庫(kù)蚊活性增大，而對(duì)埃及伊蚊和四斑按蚊的活性沒有改變，證明將短變量序列引入到loop結(jié)構(gòu)中，可以增強(qiáng)Cry殺蚊毒蛋白的活力。2005年Boonhiang Promdonkoy等[21]將Cry4Ba和cyt2Aa2基因轉(zhuǎn)入到大腸桿菌中，表達(dá)Cry4Ba毒蛋白的大腸桿菌對(duì)埃及伊蚊幼蟲具有毒殺作用，LC50為250 ng·mL-1，但是其對(duì)致倦庫(kù)蚊的幼蟲沒有毒性。cyt2Aa2毒蛋白對(duì)埃及伊蚊和致倦庫(kù)蚊具有中等毒力，LC50為305 ng·mL-1和250 ng·mL-1；共同表達(dá)Cry4Ba和cyt2Aa2毒蛋白的大腸桿菌對(duì)埃及伊蚊和致倦庫(kù)蚊幼蟲的毒力顯著提高，LC50分別為7 ng·mL-1和20 ng·mL-1，說明Cry4Ba和cyt2Aa2毒蛋白對(duì)致倦庫(kù)蚊幼蟲具有協(xié)同作用。2006年Zribi等[22]從蘇云金芽孢桿菌BUPM97中克隆得到Cry4Ba型基因，命名為Cry4BLB，Cry4BLB與之前發(fā)現(xiàn)的Cry4Ba型基因有很大不同，尤其是N-末端domainⅢ上的2個(gè)氨基酸的變化，對(duì)Cry4BLB特異性和毒力有很大的影響。將Cry4BLB基因轉(zhuǎn)入蘇云金芽孢桿菌無晶體突變株中，成功表達(dá)了Cry殺蚊毒蛋白，又將Cry4BLB轉(zhuǎn)入含有Cry2A基因的無晶體突變株中，發(fā)現(xiàn)Cry4BLB蛋白和Cry2A毒蛋白對(duì)尖音庫(kù)蚊具有協(xié)同作用。2010年P(guān)ablo Emiliano等[23]研究證明cyt1Aa可加強(qiáng)Cry4Ba的活性，實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)cyt1Aa loop結(jié)構(gòu)的β6-αE K198A，E204A和β7-k225A的突變會(huì)影響cyt1Aa和Cry4Ba的結(jié)合和協(xié)同作用。Cry4Ba SI303-304 AA雙突變后，發(fā)現(xiàn)cyt1Aa與Cry4Ba的結(jié)合加強(qiáng)，協(xié)同作用減弱，cyt1Aa在二者的協(xié)同作用中起關(guān)鍵作用。

3 問題與思考

近幾年來人們對(duì)Mtx1毒蛋白和Cry4Ba毒蛋白與其他毒蛋白的協(xié)同作用以及Mtx1毒蛋白的基因改造和Cry4Ba毒蛋白氨基酸的替換進(jìn)行了一些研究，但在研究中還有一些關(guān)鍵性問題沒能解決，我們總結(jié)了以下幾個(gè)重要方面：（1）Cry4Ba毒蛋白和Mtx1毒蛋白對(duì)靶標(biāo)昆蟲具有較高的特異性，在帶來安全性的同時(shí)，也導(dǎo)致了其殺蟲譜過窄的問題；（2）長(zhǎng)期大量使用蘇云金芽孢桿菌和球形芽孢桿菌也將導(dǎo)致抗藥性的產(chǎn)生；（3）Mtx1毒蛋白易被蛋白酶分解，導(dǎo)致其只在球形芽孢桿菌的孢子中可以檢測(cè)到，致使殺蟲效率降低；（4）Cry4Ba毒蛋白中，不同位置氨基酸的改變對(duì)其特異性和毒力具有很大的影響，而我們對(duì)其研究程度并不精細(xì)。上述內(nèi)容可作為未來研究的重點(diǎn)，其結(jié)果將對(duì)更好的開發(fā)利用球形芽孢桿菌和蘇云金芽孢桿菌防治蚊蟲有積大促進(jìn)作用。

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