員美娜，劉志鵬，王 佳，劉斯靜，池 冰，劉殿武*(.河北醫(yī)科大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院社會(huì)醫(yī)學(xué)與衛(wèi)生事業(yè)管理學(xué)教研室，河北 石家莊 05007；.河北醫(yī)科大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院流行病與衛(wèi)生統(tǒng)計(jì)學(xué)教研室，河北 石家莊 05007；3.內(nèi)蒙古自治區(qū)呼和浩特市食品化妝品監(jiān)督管理所學(xué)校食堂食品衛(wèi)生安全監(jiān)管科，內(nèi)蒙古 呼和浩特 0000；.河北醫(yī)科大學(xué)期刊社，河北 石家莊 05007)

·研究快報(bào)·

脫精氨酸補(bǔ)體C3f對刀豆蛋白A誘導(dǎo)的急性免疫性肝損傷的保護(hù)作用

員美娜1，劉志鵬2,3，王 佳2，劉斯靜4，池 冰2，劉殿武2*
(1.河北醫(yī)科大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院社會(huì)醫(yī)學(xué)與衛(wèi)生事業(yè)管理學(xué)教研室，河北 石家莊 050017；2.河北醫(yī)科大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院流行病與衛(wèi)生統(tǒng)計(jì)學(xué)教研室，河北 石家莊 050017；3.內(nèi)蒙古自治區(qū)呼和浩特市食品化妝品監(jiān)督管理所學(xué)校食堂食品衛(wèi)生安全監(jiān)管科，內(nèi)蒙古 呼和浩特 010010；4.河北醫(yī)科大學(xué)期刊社，河北 石家莊 050017)

肝炎，自身免疫性；脫精氨酸補(bǔ)體C3f；刀豆蛋白A

肝臟疾病是一個(gè)巨大的全球性公共衛(wèi)生問題，嚴(yán)重威脅著數(shù)十億人的健康[1-2]。病毒感染、自身免疫狀態(tài)、攝入酒精及一些特定藥物，均可以導(dǎo)致肝炎的發(fā)生，而且易進(jìn)展為肝硬化、肝衰竭或肝癌。目前有許多治療方法可以促進(jìn)肝功能的恢復(fù)，但是仍有很大比例的肝炎患者對于治療無有效應(yīng)答[3]。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)脫精氨酸補(bǔ)體C3f(complement C3f des-arginine,DRC3f)在輕中重度慢性乙型肝炎患者血清中表達(dá)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義[4]。提示DRC3f可能參與了肝炎病情進(jìn)展的某種機(jī)制。本研究通過建立刀豆蛋白A(Concanavalin A,Con A)誘導(dǎo)的肝損傷模型，探討外源性給予DRC3f對急性免疫性肝損傷的作用。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物：Balb/c近交系6～8周齡雄性小鼠124只，體質(zhì)量18～22g，購于河北省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。

1.2 實(shí)驗(yàn)分組與處理

1.2.1 預(yù)防性給藥實(shí)驗(yàn)：將32只小鼠隨機(jī)分為4組，即正常組、模型組、陽性對照組和DRC3f預(yù)防性給藥組，每組8只。正常組小鼠給予2次0.25mL生理鹽水。模型組、陽性對照組和DRC3f預(yù)防性給藥組小鼠分別經(jīng)尾靜脈給予0.25mL生理鹽水，500μg/kg地塞米松和800μg/kg DRC3f(上海生工生物工程技術(shù)有限公司)，1h后經(jīng)尾靜脈注射12mg/kg Con A(美國Sigma公司)。注射Con A 12h后處死小鼠，采集血清，應(yīng)用全自動(dòng)生化分析儀檢測丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶(alanine aminotransaminase,ALT)和天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶(aspartate aminotransferase,AST)水平。分離肝組織，石蠟包埋切片后進(jìn)行HE染色。

1.2.2 治療性給藥實(shí)驗(yàn)：分組及正常組處理與預(yù)防性給藥實(shí)驗(yàn)相同。模型組、陽性對照組和DRC3f治療性給藥組小鼠先經(jīng)尾靜脈注射12mg/kg Con A，0.5h后給予相應(yīng)藥物治療。12h后處死小鼠，后續(xù)處理同上。

1.2.3 生存分析實(shí)驗(yàn)：另取60只小鼠隨機(jī)分為2個(gè)大組，即預(yù)防性給藥組和治療性給藥組。然后再將每個(gè)大組隨機(jī)分為3個(gè)亞組，即模型組、陽性對照組和DRC3f組，每組10只。各組均于注射致死劑量25mg/kg Con A 1h前(預(yù)防性給藥組)或0.5h后(治療性給藥組)分別給予對應(yīng)藥物處理，觀察72h內(nèi)小鼠的生存情況，每小時(shí)記錄1次。

2 結(jié) 果

2.1 DRC3f預(yù)防性給藥對Con A誘導(dǎo)肝損傷的影響：模型組小鼠血清ALT和AST水平顯著高于正常組(P<0.01)；陽性對照組和DRC3f預(yù)防性給藥組血清ALT和AST水平較模型組均明顯降低(P<0.01)，但未達(dá)到正常組水平(P<0.01)，且陽性對照組與DRC3f預(yù)防性給藥組之間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。組織病理學(xué)結(jié)果可見，模型組小鼠肝組織出現(xiàn)大量肝細(xì)胞壞死，陽性對照組和DRC3f預(yù)防性給藥組未見明顯壞死。

2.2 DRC3f治療性給藥對Con A誘導(dǎo)肝損傷的影響：模型組小鼠血清ALT和AST水平均顯著高于正常組(P<0.01)；DRC3f治療性給藥組小鼠血清ALT和AST水平均顯著低于模型組(P<0.01)，陽性對照組小鼠血清ALT和AST水平也均低于模型組(P<0.01)，其中ALT水平略高于DRC3f治療性給藥組(P=0.044)，AST水平與DRC3f治療性給藥組相比差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.080)，但均未降至正常組水平。組織病理學(xué)結(jié)果顯示，模型組小鼠肝組織有大量肝細(xì)胞壞死，陽性對照組和DRC3f治療性給藥組肝細(xì)胞壞死情況均較模型組有所改善。

2.3 DRC3f給藥對注射致死劑量Con A小鼠生存率的影響：在預(yù)防性給藥生存率實(shí)驗(yàn)中，模型組小鼠給予25mg/kg Con A后72h生存率為20% (2/10)，中位生存時(shí)間為11h；陽性對照組小鼠72h生存率為80% (8/10)，中位生存時(shí)間為72h，生存情況較模型組有明顯改善(P=0.004)；DRC3f給藥組小鼠72h生存率為70% (7/10)，中位生存時(shí)間為72h，生存情況較模型組也得到顯著改善(P=0.01)。在治療性給藥生存率實(shí)驗(yàn)中，模型組小鼠72h生存率為20% (2/10)，中位生存時(shí)間為13h；陽性對照組小鼠72h生存率為60% (6/10)，中位生存時(shí)間為72h，生存情況較模型組有明顯改善(P=0.011)；DRC3f給藥組小鼠72h生存率為40% (4/10)，中位生存時(shí)間為37h，生存情況相比模型組也有顯著改善(P=0.029)。地塞米松和DRC3f預(yù)防性給藥實(shí)驗(yàn)組小鼠生存率和中位生存時(shí)間雖好于治療性給藥實(shí)驗(yàn)組，但二者之間差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

3 討 論

本課題組前期在尋找肝炎早期生物標(biāo)志物的研究中采用飛行時(shí)間質(zhì)譜發(fā)現(xiàn)，DRC3f在輕中度乙型肝炎患者血清中含量較高，而在重度肝炎患者血清中含量較低，表達(dá)差異明顯，提示該多肽可能參與了乙型肝炎感染及其病情進(jìn)展的某種機(jī)制[4]。此外，使用合成的DRC3f體外刺激正常人肝細(xì)胞QSG-7701，發(fā)現(xiàn)DRC3f對肝細(xì)胞增殖有促進(jìn)作用[4]。

Con A是一種植物凝集素，可以引起肝細(xì)胞壞死，導(dǎo)致血清ALT和AST水平升高。DRC3f預(yù)防性給藥組血清ALT和AST水平顯著低于模型組，模型組出現(xiàn)大面積肝細(xì)胞壞死，而DRC3f預(yù)防性給藥組小鼠肝細(xì)胞未見明顯壞死，可見DRC3f對于Con A誘導(dǎo)的急性免疫性肝損傷有保護(hù)性作用。DRC3f治療性給藥雖然也能降低ALT和AST，但組織病理學(xué)結(jié)果顯示有肝細(xì)胞壞死。Con A誘導(dǎo)的肝損傷具有劑量依賴性，肝臟損害隨藥物劑量加大而加重。為進(jìn)一步驗(yàn)證DRC3f的作用，我們檢測了注射致死劑量Con A后小鼠72h內(nèi)的生存情況。DRC3f顯著提高了小鼠的生存率，并且延長了生存時(shí)間，表明DRC3f可以改善小鼠的生存情況。

地塞米松是糖皮質(zhì)激素類藥物，具有抗炎、抗過敏、抗休克和免疫抑制作用，可用于治療自身免疫性肝炎、重度肝炎等疾病。本研究采用地塞米松作為對Con A誘導(dǎo)肝損傷發(fā)揮保護(hù)作用的陽性對照組。結(jié)果表明，地塞米松可以顯著改善Con A誘導(dǎo)的肝損傷，降低血清ALT和AST水平，減少肝細(xì)胞壞死，改善給予致死劑量Con A小鼠的生存情況，效果與DRC3f接近。但是它在較大劑量給藥時(shí)容易引起消化道潰瘍或類腎上腺皮質(zhì)功能亢進(jìn)綜合征，還可能引起并發(fā)感染等不良反應(yīng)，因此其在臨床上的應(yīng)用受到一定限制。

體外合成DRC3f方法較簡單，容易獲得，對人體侵入性小，對急性免疫性肝炎預(yù)防和治療效果較好，但是其應(yīng)用的安全性和作用機(jī)制尚不十分明確，有待于進(jìn)一步的研究。

[1] GUAN YS,HE Q.A Current update on the rule of alternative and complementary medicine in the treatment of liver diseases[J].Evid Based Complement Alternat Med,2013,2013:321234.

[2] 曹慧穎,邵鵬,石金升.骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞治療肝纖維化研究進(jìn)展[J].河北醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào),2012,33 (2):240-242.

[3] YAN S,WANG L,LIU N,et al.Critical role of interleukin-17/ interleukin-17 receptor axis in mediating Con A-induced hepatitis[J].Immunol Cell Biol,2012,90(4):421-428.

[4] 李曼,王劍，戴二黑，等.慢性乙型肝炎血清差異性多肽DRC3f 的鑒定及作用研究[J].衛(wèi)生研究,2011,40 (3):315-319.

(本文編輯：趙麗潔)

2014-10-15；

2014-11-18

河北省科技計(jì)劃項(xiàng)目(13277732D)；河北省衛(wèi)生廳醫(yī)學(xué)科學(xué)研究重點(diǎn)課題(20110041)

員美娜(1988-)，女，滿族，河北唐山人，河北醫(yī)科大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院助教，醫(yī)學(xué)碩士，從事肝病分子流行病學(xué)研究。

*通訊作者。E-mail:liudw56@tom.com

R575.1

B

1007-3205(2014)12-1460-02

10.3969/j.issn.1007-3205.2014.12.036