張萌 黃剛 周志剛 楊金良

胃食管反流病(gastroesophageal reflux disease，GERD)是指胃、腸內(nèi)容物反流至食管引起的各種癥狀或食管黏膜組織損傷，是胃腸道的常見疾病之一。反流可引起燒心、反酸、胸痛甚至哮喘、咳嗽等癥狀，易長(zhǎng)期反復(fù)發(fā)作且治療效果欠佳，嚴(yán)重影響患者的生活質(zhì)量。臨床研究表明，奧美拉唑?qū)Ψ戳餍允彻苎?RE)有一定的療效［1－3］，但對(duì)其作用機(jī)制報(bào)道較少。本研究應(yīng)用反流性食管黏膜損傷大鼠模型，觀察了奧美拉唑?qū)Ψ戳魇彻莛つp傷的作用，同時(shí)觀察了其對(duì)增殖細(xì)胞核抗原(PCNA)、腫瘤抑制基因(p21)、細(xì)胞周期蛋白(Cyclin)D1、細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶(Cylin-dependentkinases，CDK)4表達(dá)的影響，進(jìn)一步探討了其作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物分組 健康雄性SD大鼠75只，體重220～250 g，由河北省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。大鼠購(gòu)入后適應(yīng)環(huán)境1周，分籠飼養(yǎng)，自由進(jìn)食標(biāo)準(zhǔn)飼料及飲水。隨機(jī)將大鼠分為5組:假手術(shù)組、胃食管反流動(dòng)物模型組(模型組)、奧美拉唑低、中、高劑量組，每組15只。

1.2 模型制備及給藥 術(shù)前大鼠禁食24 h，禁水2 h。大鼠腹腔注射10%水合氯醛(30 ml/kg)麻醉，采用食管下段與胃底吻合術(shù)，上腹部正中切口，于胃大彎側(cè)食管下段(距胃食管交接部0.5～1.5 cm處)和胃底近食管下段處分別做1.0 cm切口行側(cè)側(cè)吻合。假手術(shù)組上腹部正中切口，暴露胃食管及十二指腸于腹腔外約10 min后關(guān)閉腹腔。于術(shù)后第6天分別將奧美拉唑低劑量(10 mg)、中劑量(20 mg)、高劑量(40 mg)給大鼠灌胃，假手術(shù)組和模型組大鼠給予等容量的0.9%氯化鈉溶液，連續(xù)給藥8周。取食管下段(包括吻合口)進(jìn)行縱行剖開，肉眼觀察黏膜狀況，迅速分為兩份，一份放入液氮罐內(nèi)冰凍保存行免疫組織化學(xué)檢測(cè)。另一份呈條狀置于10%中性甲醛溶液中固定，石蠟包埋，組織切片，HE染色，光鏡觀察組織學(xué)改變。

1.3 免疫組織化學(xué)檢測(cè) p21，PCNA，CyclinD1，CDK4蛋白表達(dá) 各例石蠟包埋組織均取6張切片，4張分別進(jìn)行蛋白免疫組織化學(xué)染色，1張用PBS液代替一抗作為陰性對(duì)照，1張備用。用已知陽(yáng)性切片作為陽(yáng)性對(duì)照。所用載玻片均經(jīng)多聚賴氨酸處理，連續(xù)切片厚4 μm，一抗為小鼠抗人p21單克隆抗體(稀釋比例1∶50)，小鼠抗人CDK4單克隆抗體(稀釋比例1∶50)、兔抗人CyclinD1單克隆抗體(稀釋比例1∶50)、兔抗人PCNA單克隆抗體(稀釋比例1∶100)、二抗為生物素化羊抗兔或小鼠 IgG，以0.01 mol/L磷酸鹽緩沖液(PBS)代替一抗作陰性對(duì)照，

1.4 免疫組化圖像分析 p21、PCNA、CyclinD1、CDK4蛋白表達(dá)的免疫組化結(jié)果，應(yīng)用HPIAS-1000高清晰度彩色病理圖文分析系統(tǒng)分析。p21蛋白的陽(yáng)性表達(dá)分析采用灰度值的方法;選擇免疫組化切片，以組織空白處入射光的值定標(biāo)，每張切片選取6個(gè)高倍視野(10×40)，對(duì)食管黏膜上皮細(xì)胞胞漿區(qū)的灰度值進(jìn)行測(cè)量，取平均值作為測(cè)定值，每組分析10只動(dòng)物的切片，隨陽(yáng)性表達(dá)強(qiáng)度增加，灰度值減小。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 應(yīng)用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)軟件，計(jì)量資料以表示，組間比較采用單因素方差分析(One-Way ANOVA)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 食管大體形態(tài)變化 假手術(shù)組大鼠食管顏色淡紅，有光澤，黏膜光滑。模型組大鼠食管顏色變淡白，黏膜粗糙、增厚、皺襞灰白色斑塊狀增生。與模型組比較，奧美拉唑低、中、高劑量治療組大鼠食管病變明顯減輕。

2.2 食管黏膜光鏡下形態(tài)變化 HE染色顯示，假手術(shù)組大鼠食管各層結(jié)構(gòu)完整，黏膜厚薄適中，黏膜基底膜清楚，各層細(xì)胞排列整齊，表面可見較少的角化。模型組大鼠黏膜層增厚，基底細(xì)胞層及棘細(xì)胞層細(xì)胞數(shù)目增多，角化層增厚，局部黏膜基底細(xì)胞層明顯增生，部分黏膜組織向外呈乳頭樣突起。與模型組比較，奧美拉唑治療組大鼠食管黏膜損傷及增生病變明顯減輕。見圖1～5。

圖1 假手術(shù)組(HE×100)

圖2 模型組(HE×100)

圖3 奧美拉唑低劑量組(HE×100)

圖4 奧美拉唑中劑量組(HE×100)

圖5 奧美拉唑高劑量組(HE×100)

2.3 免疫組織化學(xué)檢測(cè) p21蛋白的陽(yáng)性反應(yīng)定位于細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核，假手術(shù)組大鼠食管黏膜有p21蛋白表達(dá)，模型組大鼠食管黏膜p21蛋白表達(dá)減少，與模型組比較，奧美拉唑治療組大鼠食管p21蛋白表達(dá)顯著增強(qiáng)(P＜0.05)。PCNA蛋白的陽(yáng)性反應(yīng)定位于細(xì)胞核，假手術(shù)組大鼠食管基底細(xì)胞層有基礎(chǔ)陽(yáng)性表達(dá)，與假手術(shù)組比較，模型組大鼠食管黏膜陽(yáng)性細(xì)胞表達(dá)數(shù)及陽(yáng)性細(xì)胞表達(dá)率明顯升高，陽(yáng)性細(xì)胞的表達(dá)也從基底細(xì)胞增加至棘細(xì)胞層乃至全層，與模型組比較，奧美拉唑治療組大鼠食管PCNA蛋白表達(dá)顯著降低(P＜0.05)。CyclinD1蛋白陽(yáng)性反應(yīng)定位于細(xì)胞胞漿，表現(xiàn)為胞漿內(nèi)出現(xiàn)棕黃色顆?；驁F(tuán)塊，假手術(shù)組的基底細(xì)胞層及棘細(xì)胞層有陽(yáng)性基礎(chǔ)表達(dá)，模型組大鼠食管CyclinD1蛋白表達(dá)明顯增強(qiáng)，與模型組比較，奧美拉唑治療組大鼠食管CyclinD1蛋白表達(dá)顯著降低(P＜0.05)。CDK4蛋白陽(yáng)性反應(yīng)定位于細(xì)胞核及胞漿，表現(xiàn)為胞核黃染和(或)胞漿內(nèi)出現(xiàn)棕黃色顆?；驁F(tuán)塊，假手術(shù)組的基底細(xì)胞層及棘細(xì)胞層有陽(yáng)性基礎(chǔ)表達(dá)，模型組大鼠食管CDK4蛋白表達(dá)顯著增強(qiáng)，與模型組比較，奧美拉唑治療組大鼠食管CDK4蛋白表達(dá)明顯降低(P＜0.05)。見表1。

表1 5組相關(guān)基因蛋白表達(dá)比較n=10，±s

表1 5組相關(guān)基因蛋白表達(dá)比較n=10，±s

注:與模型組比較，*P ＜0.05

組別 蛋白表達(dá)的灰值p21 PCNA CyclinD1 CDK4模型組133±7 19±4 75±6 60±5假手術(shù)組 143±10* 131±9* 139±9* 125±8*奧美拉唑低劑量組 114±6* 51±7* 98±7* 71±6*奧美拉唑中劑量組 90±4* 86±8* 120±7* 97±6*奧美拉唑高劑量組 69±4 124±9* 133±8* 122±7*

3 討論

GERD是由胃內(nèi)容物反流引起不適和(或)并發(fā)癥的一種疾病，是影響胃腸道的常見病之一。反流性食管炎(RE)是GERD癥狀之一［4］。本實(shí)驗(yàn)采用胃食管反流手術(shù)方式復(fù)制反流性食管黏膜損傷的大鼠模型，結(jié)果顯示，模型動(dòng)物均出現(xiàn)食管黏膜損傷，黏膜粗糙、增厚、皺襞灰白色斑塊狀增生，表明模型復(fù)制成功。

正常的食管鱗狀上皮細(xì)胞大多數(shù)處于靜止?fàn)顟B(tài)，反流物對(duì)食管黏膜的刺激損傷可導(dǎo)致基底層細(xì)胞分化增殖增強(qiáng)，進(jìn)入活躍的細(xì)胞周期，食管上皮乳頭延長(zhǎng)、基底層細(xì)胞增厚等［5］。因而上皮增殖的程度可體現(xiàn)損傷的程度。細(xì)胞周期(cell cycle)是細(xì)胞生命活動(dòng)的基本過(guò)程，指從細(xì)胞分裂結(jié)束開始，到下一次細(xì)胞分裂結(jié)束為止的過(guò)程，DNA合成和細(xì)胞分裂是細(xì)胞周期的兩個(gè)主要事件。嚴(yán)格有序的細(xì)胞周期調(diào)控機(jī)制可保證細(xì)胞生命活動(dòng)的正常運(yùn)行。但在許多疾病中，病理刺激導(dǎo)致細(xì)胞周期調(diào)控機(jī)制紊亂，最終導(dǎo)致細(xì)胞死亡。目前發(fā)現(xiàn)的與細(xì)胞周期調(diào)控相關(guān)的分子主要有5種:細(xì)胞周期蛋白(cyclin)、細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶(cyclin-dependent kinases，CDKs)、細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶抑制劑(cyclin-dependent kinase inhibitor，CKI)、視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤蛋白(retinoblastoma，Rb)、E2F轉(zhuǎn)錄因子。其中CDKs是調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的核心，Cyclins對(duì)CDKs具有正性調(diào)控作用，CKIs有負(fù)性調(diào)控作用，共同構(gòu)成了細(xì)胞周期調(diào)控的分子基礎(chǔ)。CyclinD1是G1期細(xì)胞周期蛋白的一員，其通過(guò)激活周期蛋白依賴性激酶Cdk4和Cdk6來(lái)使Rb磷酸化，Rb磷酸化導(dǎo)致E2F釋放，隨后E2F與其二聚體伙伴(dimerization partner protein，DP)結(jié)合形成有功能的異二聚體后，結(jié)合到靶基因啟動(dòng)子中特殊的DNA序列上，調(diào)節(jié)基因轉(zhuǎn)錄，促進(jìn)細(xì)胞通過(guò)G1/S調(diào)控點(diǎn)。PCNA是一種僅在增殖細(xì)胞中合成與表達(dá)的分子量為36 kD多肽，在DNA復(fù)制過(guò)程中起作用，它在晚G1期和S期合成，在正常細(xì)胞中與Cyclin、CDK及p21組成復(fù)合物調(diào)節(jié)細(xì)胞由G1期向S期過(guò)度，在DNA的半保留復(fù)制過(guò)程中起關(guān)鍵作用，在真核生物的細(xì)胞周期調(diào)控中起重要作用［6，7］。長(zhǎng)期靜止?fàn)顟B(tài)的細(xì)胞基本不表達(dá)PCNA，處于增殖狀態(tài)的細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞中PCNA的表達(dá)明顯增強(qiáng)，因而其表達(dá)被認(rèn)為是評(píng)價(jià)細(xì)胞增殖活性的重要指標(biāo)及臨床評(píng)價(jià)患者預(yù)后的參考［8－10］。細(xì)胞周期素(Cyclin)D1及細(xì)胞周期素依賴性激酶(CDK)4在多種腫瘤組織中過(guò)度表達(dá)，且具有促進(jìn)細(xì)胞增殖的作用。Cyclin D1基因是一類在細(xì)胞周期中含量呈周期性變化的細(xì)胞周期調(diào)節(jié)蛋白，是細(xì)胞周期素依賴性激酶(CDK)的正向調(diào)節(jié)因子，調(diào)節(jié)著細(xì)胞增殖、分化和死亡的過(guò)程。Cyclin D1的過(guò)度表達(dá)，可導(dǎo)致pRB蛋白的磷酸化修飾提前實(shí)現(xiàn)，加速細(xì)胞從G1期到S期的轉(zhuǎn)變，并促進(jìn)細(xì)胞DNA的復(fù)制過(guò)程。p21作為一個(gè)廣譜的細(xì)胞周期依賴性激酶(CDK)抑制劑和細(xì)胞周期的負(fù)調(diào)控因子，具有阻止細(xì)胞通過(guò)G1/S期“關(guān)卡”的作用，從而抑制細(xì)胞增殖。

本研究表明，PCNA蛋白的陽(yáng)性反應(yīng)定位于細(xì)胞核，CyclinD1蛋白陽(yáng)性反應(yīng)定位于細(xì)胞胞漿，表現(xiàn)為胞漿內(nèi)出現(xiàn)棕黃色顆?；驁F(tuán)塊，CDK4蛋白陽(yáng)性反應(yīng)定位于細(xì)胞核及胞漿，表現(xiàn)為胞核黃染和(或)胞漿內(nèi)出現(xiàn)棕黃色顆?；驁F(tuán)塊，p21蛋白的陽(yáng)性反應(yīng)定位于細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核。正常大鼠食管黏膜有一定的PCNA、CyclinD1、CDK4和p21蛋白陽(yáng)性表達(dá)，反流性食管黏膜損傷后，大鼠食管黏膜PCNA、CyclinD1和CDK4蛋白表達(dá)明顯增強(qiáng)，p21蛋白陽(yáng)性表達(dá)顯著減弱，經(jīng)奧美拉唑治療后，大鼠食管黏膜損傷明顯減輕，食管黏膜PCNA、CyclinD1和CDK4蛋白表達(dá)明顯降低，p21蛋白陽(yáng)性表達(dá)顯著增強(qiáng)，上述結(jié)果提示，奧美拉唑通過(guò)下調(diào)細(xì)胞增殖相關(guān)基因PCNA、CyclinD1和CDK4蛋白表達(dá)，上調(diào)p21蛋白表達(dá)，可能是其發(fā)揮治療反流性食管損傷的重要作用機(jī)制，其詳細(xì)機(jī)制有待進(jìn)一步研究。

1 許明清.奧美拉唑治療反流性食管炎的療效觀察.吉林醫(yī)學(xué)，2012，33:2768-2769.

2 黃敏.奧美拉唑聯(lián)合西沙必利治療反流性食管炎臨床觀察.山西醫(yī)藥雜志，2008，37:253-254.

3 李獻(xiàn)平.奧美拉唑治療反流性食管炎臨床觀察.現(xiàn)代中西醫(yī)結(jié)合雜志，2004，13:2169-2170.

4 林三仁.中國(guó)胃食管反流病共識(shí)意見簡(jiǎn)介.中華醫(yī)學(xué)會(huì)第七次全國(guó)消化病學(xué)術(shù)會(huì)議論文匯編，2007.35-36.

5 Haggitt RC.Histopathology of reflux-induced esophageal and supraesophageal injuries.AM J Med，2000，108(Suppl 4a):1095-1115.

6 Kim R，Clarke MR，Melhem MF，et al.Expression of p53，PCNA，and C-erbB2 in Barrett’s metaplasia and adenocarcinoma.Dig Dis Sei，1997，42:2453.

7 王天佑，劉賓，王立東，等.增殖細(xì)胞核抗原和p53在反流性食管炎黏膜的表達(dá)及其意義.中華內(nèi)科雜志，2002，41:39-42.

8 Kihara C，Seki T，F(xiàn)unkawa Y，et al.Mutations in zincbinding domain of p53 as a prognostic marker of esophageal cancer patients.Jpn J Cancer Res，2000，91:190-198.

9 Diez M，Ramos P，Medrano MJ，et al.Preoperatively irradiated rectal carcinoma:Analysis of the histopathologic response and predictive value of proliferating cell nuclear antigen，immunostianing.Oncology，2003，64:213-219.

10 葉萍，李兆申，許國(guó)銘，等.反流性食管炎和食管腺癌組織中P16、P53、PCNA表達(dá)及臨床意義.解放軍醫(yī)學(xué)雜志，2000，25:326-329.