李文宏，王 閃，張永強(qiáng)，宋 浩，向忠遠(yuǎn)，張忠智,徐飛艷

(1.中國(guó)石油長(zhǎng)慶油田分公司勘探開(kāi)發(fā)研究院，陜西 西安 710018；2.低滲透油氣田勘探開(kāi)發(fā)國(guó)家工程實(shí)驗(yàn)室，陜西 西安 710018；3.中國(guó)石油大學(xué)(北京)化學(xué)工程學(xué)院，北京 102249)

油藏內(nèi)源微生物群落是在油田開(kāi)發(fā)注水過(guò)程中隨注水進(jìn)入油藏，并且在一定時(shí)期內(nèi)在數(shù)量和種類上都能夠保持相對(duì)穩(wěn)定的微生物群落，這些微生物不僅代謝類型多，而且變異性大，在微生物生態(tài)系統(tǒng)中占有非常重要的位置。大多數(shù)油藏環(huán)境是典型的極端環(huán)境，具有厭氧、高溫、高壓和高礦化度等特點(diǎn)，極端的儲(chǔ)層環(huán)境造就了獨(dú)特的油藏微生物生態(tài)系統(tǒng)，形成了豐富且有特色的油藏極端微生物資源和基因資源[1-2]。由于菌種的來(lái)源不同，內(nèi)源微生物采油技術(shù)同外源微生物采油技術(shù)相比不僅不存在菌種適應(yīng)性的問(wèn)題，而且工藝簡(jiǎn)單、投資少、微生物代謝活性高[3-7]，具有較大的優(yōu)勢(shì)。激活油藏中的內(nèi)源微生物是進(jìn)行內(nèi)源微生物采油的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，也是進(jìn)行內(nèi)源微生物采油的基礎(chǔ)，因而利用合適的激活體系選擇性地激活油藏中有益的采油功能菌、抑制有害菌，是內(nèi)源微生物采油研究的重要課題[8]，其中激活體系的選擇對(duì)于激活效果至關(guān)重要。

由于油藏中氮、磷等營(yíng)養(yǎng)元素一般極度缺乏，國(guó)外通常采用向地層注入添加了氮、磷等的注入水的方法來(lái)激活內(nèi)源微生物。然而研究表明，在油藏的極端環(huán)境下僅補(bǔ)充氮、磷是不夠的，適當(dāng)補(bǔ)充以糖類為主的外加碳源是提高微生物驅(qū)油效果的重要方法[9]。目前已報(bào)道的常用碳源有糖蜜、玉米糖、玉米發(fā)酵廢水、麥芽糊精、乳酸生產(chǎn)廢水[10-11]等。

作者在此針對(duì)靖安油田五里灣一區(qū)油藏高鹽和低滲透的特點(diǎn)，對(duì)其內(nèi)源微生物進(jìn)行普查和分析，在初步篩選營(yíng)養(yǎng)成分的基礎(chǔ)上進(jìn)行碳源、氮源、磷源的篩選，然后進(jìn)一步優(yōu)化它們的用量，旨在篩選出適合五里灣一區(qū)高鹽低滲儲(chǔ)層的激活體系，從產(chǎn)氣量、菌濃和有益菌數(shù)量的變化等方面評(píng)價(jià)五里灣一區(qū)油藏內(nèi)源微生物驅(qū)油提高原油采收率的潛力。

1 實(shí)驗(yàn)

1.1 實(shí)驗(yàn)區(qū)塊概況

靖安油田五里灣一區(qū)含油層系為三疊系延長(zhǎng)組6油層組，油層埋深1 210 m，平均孔隙度為13%，平均滲透率為1.81 mD，油層溫度54 ℃。地層水礦化度為80 506 mg·L-1，水型為CaCl2，地層原油黏度2.0 mPa·s，屬于低滲透、高鹽油藏。1996年投入開(kāi)發(fā)，1997年采用反九點(diǎn)法面積注水井網(wǎng)開(kāi)發(fā)。該區(qū)平均單井產(chǎn)油量為4.6 t·d-1。該區(qū)所有生產(chǎn)井均為壓裂后投產(chǎn)，但是壓裂后的油層含水率上升較快，難以保持穩(wěn)產(chǎn)。開(kāi)發(fā)過(guò)程的主要矛盾為水驅(qū)儲(chǔ)量動(dòng)用程度呈下降趨勢(shì)和見(jiàn)水油井含水上升較快，需要新的技術(shù)保持穩(wěn)產(chǎn)。

1.2 材料與儀器

樣品來(lái)源：靖安油田五里灣一區(qū)油井的采出液。

高壓滅菌鍋、恒溫?fù)u床、超凈工作臺(tái)、分析天平、張力儀、離心機(jī)等。

1.3 方法

1.3.1 油藏內(nèi)源微生物分布的調(diào)查

油藏內(nèi)源微生物群落結(jié)構(gòu)的調(diào)查采用中石油廊坊分院推薦的“油藏本源菌常規(guī)檢測(cè)推薦方法試劑瓶法”。根據(jù)油藏井網(wǎng)和生產(chǎn)特點(diǎn)，在油藏內(nèi)選取有代表性的10口油井取樣營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，分析產(chǎn)出液中內(nèi)源微生物群落結(jié)構(gòu)和數(shù)量。

1.3.2 激活體系的碳源、氮源、磷源的單因素實(shí)驗(yàn)篩選

碳源包括糖蜜和玉米漿干粉；氮源包括NaNO3、KNO3、NH4NO3和蛋白胨；磷源包括酵母粉、KH2PO4和NaH2PO4。

碳源篩選實(shí)驗(yàn)中，碳源的添加量為0.5%，氮源為0.2%NaNO3，磷源為0.1%酵母粉；氮源篩選實(shí)驗(yàn)中，碳源為1%糖蜜，磷源為0.1%酵母粉；因油層采出液為CaCl2水型，其中含有大量的Ca2+，在進(jìn)行磷源的篩選時(shí)必須考慮是否會(huì)產(chǎn)生沉淀，為此，設(shè)置了加入螯合劑(EDTANa2)的對(duì)照組；磷源篩選實(shí)驗(yàn)中碳源為1%糖蜜，氮源為0.2%NaNO3。

激活實(shí)驗(yàn)是在100 mL醫(yī)用小瓶中加入設(shè)計(jì)好的激活體系成分，再加入2%的原油，121 ℃高溫高壓滅菌后加入50 mL采出液，用已滅菌的膠塞密封(限氧-厭氧)，置于45 ℃(產(chǎn)出水溫度)的恒溫?fù)u床150 r·min-1培養(yǎng)3 d。發(fā)酵液10 000 r·min-1、4 ℃下離心10 min，去除上清液，用等體積的磷酸鹽緩沖溶液(PBS)重懸，以PBS緩沖溶液作為對(duì)照，測(cè)定其OD600值，以3 d產(chǎn)氣量和菌濃OD600值作為評(píng)價(jià)指標(biāo)。每組實(shí)驗(yàn)做3個(gè)平行。

1.3.3 激活體系的優(yōu)化

1.3.3.1 PB實(shí)驗(yàn)

為了防止其它因素造成的顯著性影響，Plackett-Burman(PB)實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)[12]中，兩水平間的差值不能過(guò)大[13]?；趩我蛩貙?shí)驗(yàn)結(jié)果，利用Design Expert 8.0.7設(shè)計(jì)軟件，以1.5倍步長(zhǎng)設(shè)計(jì)PB實(shí)驗(yàn)，以產(chǎn)氣量作為響應(yīng)值。利用設(shè)計(jì)Design expert 8.0.7設(shè)計(jì)軟件進(jìn)行實(shí)驗(yàn)結(jié)果的方差、顯著性等分析，找出對(duì)產(chǎn)氣量影響最為顯著的因素。

1.3.3.2 最陡爬坡實(shí)驗(yàn)

針對(duì)PB實(shí)驗(yàn)確定的顯著因素，設(shè)計(jì)合適步長(zhǎng)進(jìn)行最陡爬坡實(shí)驗(yàn)以得到最大響應(yīng)值，以作為響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)中中心組合設(shè)計(jì)的中心點(diǎn)。

1.3.3.3 響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)

通過(guò)PB實(shí)驗(yàn)得到了激活體系中影響顯著的因素，為了分析各因素之間的交互作用，得到最優(yōu)激活體系配方并建立其應(yīng)用模型，利用Design Expert 8.0.7設(shè)計(jì)軟件設(shè)計(jì)了響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)。在中心組合實(shí)驗(yàn)(central composite experiment,CCD)中同樣取一個(gè)低水平和一個(gè)高水平，盡量使最陡爬坡實(shí)驗(yàn)中最佳組合的因素的含量處于響應(yīng)面設(shè)計(jì)中高低水平的中心。

2 結(jié)果與討論

2.1 油藏內(nèi)源微生物的分布(表1)

表1油藏內(nèi)源微生物的類型與數(shù)量/(CFU·mL-1)

Tab.1 The type and number of indigenous microorganisms in reservoir/(CFU·mL-1)

注：NRB為硝酸鹽還原菌；FMB為發(fā)酵菌；HOB為烴氧化菌；SRB為硫酸鹽還原菌；TGB為腐生菌。

由表1可見(jiàn)，靖安油田五里灣一區(qū)10口油井的油藏中有不同類型且數(shù)量較多的微生物，生物潛力較大。只要添加合適的激活劑，最大限度地激活油藏中的有益菌，抑制有害菌，就具有實(shí)施內(nèi)源微生物驅(qū)油的可能。

2.2 碳源、氮源、磷源的篩選和優(yōu)化

微生物的代謝產(chǎn)氣是一個(gè)相當(dāng)復(fù)雜的生物化學(xué)過(guò)程，產(chǎn)氣量的多少和氣體成分不僅與細(xì)菌種類有關(guān)，還與培養(yǎng)基營(yíng)養(yǎng)成分密切相關(guān)。營(yíng)養(yǎng)成分篩選的單因素實(shí)驗(yàn)方案和結(jié)果見(jiàn)表2。

表2營(yíng)養(yǎng)成分的單因素實(shí)驗(yàn)篩選方案及結(jié)果

Tab.2 The program and results of single factor experiment for screening of nutritional components

2.2.1 碳源的篩選與優(yōu)化

由表2可見(jiàn)，糖蜜的產(chǎn)氣效果及對(duì)地層微生物激活效果要好于玉米漿干粉。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)以玉米漿干粉為碳源進(jìn)行激活時(shí)產(chǎn)生了大量的硫化氫氣體，推測(cè)玉米漿干粉激活了硫酸鹽還原菌，故玉米漿干粉不可用。確定糖蜜為激活體系的適宜碳源。

進(jìn)一步以0.2%NaNO3為氮源、0.1%酵母粉為磷源，測(cè)定不同濃度糖蜜為碳源時(shí)的3 d產(chǎn)氣量和OD600值，結(jié)果見(jiàn)圖1。

圖1 碳源濃度優(yōu)化結(jié)果Fig.1 The results of optimization of carbon source concentration

由圖1可見(jiàn)，不加糖蜜時(shí)產(chǎn)氣量和OD600值都很低，隨著糖蜜濃度的增大，產(chǎn)氣量和OD600值均相應(yīng)上升，當(dāng)糖蜜的濃度達(dá)到1.2%時(shí)，產(chǎn)氣量達(dá)到94 mL、OD600值也達(dá)到最高；此后再增大糖蜜濃度，產(chǎn)氣量和OD600值反而下降。這說(shuō)明營(yíng)養(yǎng)過(guò)度缺乏或過(guò)剩都會(huì)抑制微生物的生長(zhǎng)，進(jìn)而影響到產(chǎn)氣量，因此，將糖蜜的濃度初步定為1.2%。

2.2.2 氮源的篩選與優(yōu)化

由表2可見(jiàn)，以NaNO3、KNO3、NH4NO3為氮源時(shí)，產(chǎn)氣量相近，其中以NaNO3為氮源時(shí)菌濃最大，OD600值達(dá)到1.933；相比其它3種氮源，蛋白胨的產(chǎn)氣量和OD600值均不理想。故確定NaNO3作為激活體系的適宜氮源。進(jìn)一步以1%糖蜜為碳源、0.1%酵母粉為磷源，測(cè)定不同濃度NaNO3為氮源時(shí)的3 d產(chǎn)氣量和OD600值，結(jié)果見(jiàn)圖2。

圖2 氮源濃度優(yōu)化結(jié)果Fig.2 The results of optimization of nitrogen source concentration

由圖2可見(jiàn)，在NaNO3濃度很低時(shí)，隨著NaNO3濃度的增大，產(chǎn)氣量和OD600值均上升；當(dāng)NaNO3濃度達(dá)到0.25%時(shí)，產(chǎn)氣量和OD600值同時(shí)達(dá)到最大；此后再增大NaNO3濃度，產(chǎn)氣量和OD600值反而下降。因此，將NaNO3的濃度初步定為0.25%。

2.2.3 磷源的篩選與優(yōu)化

由表2可見(jiàn)，以有機(jī)磷源酵母粉為磷源時(shí)，產(chǎn)氣量和OD600值與無(wú)機(jī)磷源KH2PO4、NaH2PO4相差不大。但是由于該油藏采出液中含有大量Ca2+，加入無(wú)機(jī)磷源會(huì)有沉淀生成，雖然加入螯合劑EDTANa2后，沉淀大大減少，但是其產(chǎn)氣量和OD600值卻不理想，推測(cè)是由于EDTANa2抑制了微生物的生長(zhǎng)。因此，確定酵母粉作為激活體系的適宜磷源。

進(jìn)一步以1%糖蜜為碳源、0.2%NaNO3為氮源，測(cè)定不同濃度酵母粉為磷源時(shí)的3 d產(chǎn)氣量和OD600值，結(jié)果見(jiàn)圖3。

圖3 磷源濃度優(yōu)化結(jié)果Fig.3 The results of optimization of phosphorous source concentration

由圖3可見(jiàn)，不添加酵母粉時(shí)，產(chǎn)氣量和OD600值都很低；隨著酵母粉濃度的增大，產(chǎn)氣量和OD600值均明顯上升；當(dāng)酵母粉濃度達(dá)到0.08%時(shí)，產(chǎn)氣量和OD600值同時(shí)達(dá)到最大；此后繼續(xù)增大酵母粉的濃度，產(chǎn)氣量明顯下降，而OD600值變化不大?？梢?jiàn)酵母粉對(duì)于微生物的生長(zhǎng)是必需的，但是只要微量的酵母粉就可以滿足微生物的需要。因此，將酵母粉的濃度初步定為0.08%。

2.3 PB實(shí)驗(yàn)結(jié)果與分析

PB實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及各變量的響應(yīng)結(jié)果見(jiàn)表3，實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析見(jiàn)表4。

表3Plackett-Burman實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果

Tab.3 Design and results of Plackett-Burman experiment

表4Plackett-Burman實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析

Tab.4 Analysis of Plackett-Burman experiment results

變量系數(shù)(coefficient)絕對(duì)值的大小代表了該變量對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的影響。絕對(duì)值越大，表明該變量對(duì)結(jié)果的影響越大，變量的P值代表了該變量導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)結(jié)果出現(xiàn)不符合預(yù)測(cè)情況的概率，即該變量的顯著程度。P值越小，表明該變量對(duì)預(yù)測(cè)結(jié)果的影響越顯著。由表4可見(jiàn)，糖蜜濃度、酵母粉濃度和FeSO4濃度3個(gè)因素對(duì)產(chǎn)氣量的影響最為顯著(P<0.05)，且糖蜜濃度表現(xiàn)為正效應(yīng)，酵母粉濃度和FeSO4濃度表現(xiàn)為負(fù)效應(yīng)，即增大糖蜜的濃度、減小酵母粉和FeSO4的濃度有利于提高激活過(guò)程中地層水中微生物的產(chǎn)氣量。因此，選擇糖蜜、酵母粉和FeSO43個(gè)因素進(jìn)一步優(yōu)化分析，通過(guò)最陡爬坡實(shí)驗(yàn)確定產(chǎn)氣量最佳點(diǎn)的范圍。

2.4 最陡爬坡實(shí)驗(yàn)結(jié)果(表5)

由表5可見(jiàn)，第5組實(shí)驗(yàn)產(chǎn)氣量最高，且其前后兩組的產(chǎn)氣量也相當(dāng)高，因此選擇第5組因素的濃度作為響應(yīng)面優(yōu)化實(shí)驗(yàn)中心組合設(shè)計(jì)的中心點(diǎn)。

表5最陡爬坡實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果

Tab.5Designandresultsofsteepestascentpathexperiment

實(shí)驗(yàn)號(hào)糖蜜濃度/%酵母粉濃度/%FeSO4濃度/%產(chǎn)氣量/mL10.650.100.00403620.800.090.00355330.950.080.00306741.100.070.00258251.250.060.002010861.400.050.00159571.550.040.00108981.700.030.000588

2.5 中心組合設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果及響應(yīng)面分析

為考察糖蜜(A)、酵母粉(B)、FeSO4(C)3個(gè)因素間的交互作用，設(shè)計(jì)3因素3水平的中心組合實(shí)驗(yàn)，共15組實(shí)驗(yàn)。中心組合實(shí)驗(yàn)的設(shè)計(jì)方案和結(jié)果見(jiàn)表6，回歸性分析見(jiàn)表7。

表6中心組合實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)方案及結(jié)果

Tab.6Designandresultsofcentralcompositeexperiment

實(shí)驗(yàn)號(hào)A/%B/%C/%產(chǎn)氣量/mL11.00.040.00206021.50.040.00208531.00.080.00208041.50.080.00208851.00.060.00208261.50.060.00157271.00.060.00257381.50.060.00258391.250.040.001588101.250.080.001580111.250.040.002098121.250.080.002592131.250.060.0020113141.250.060.0025102151.250.060.0015108

由表7可見(jiàn)，在3個(gè)因素中，糖蜜濃度、FeSO4濃度對(duì)激活過(guò)程中微生物的產(chǎn)氣量影響是顯著的。

三維響應(yīng)面和等高線圖如圖4所示。

由圖4可見(jiàn)，3個(gè)等高線圖均未呈橢圓形，表明3個(gè)因素間的交互作用并不顯著，這與表7所示各因素交互作用的P值大于0.05的結(jié)論相一致。

通過(guò)中心組合實(shí)驗(yàn)，獲得產(chǎn)氣量與糖蜜濃度、酵母粉濃度和FeSO4濃度之間的關(guān)系式為：

產(chǎn)氣量=105.23-14.13A+10.79B+30.26C-4.25AB+2.24AC+5.63BC-24.90A2-13.44B2-15.66C2

(1)

表7中心組合實(shí)驗(yàn)回歸性分析

Tab.7Regressionanalysisofcentralcompositeexperiment

項(xiàng)系數(shù)平方和自由度均方F值P值/Prob>FModel-2549.569283.286.070.0306A-14.13252.261252.265.400.0676B10.79167.561167.563.390.1167C30.26521.201521.2011.170.0205AB-4.2572.25172.251.550.2686BC2.2411.44111.440.250.6416AC5.6372.25172.251.550.2686A2-24.901710.8111710.8136.650.0018B2-14.44575.441575.4412.330.0171C2-15.66569.751569.7512.210.0174

通過(guò)響應(yīng)面圖的凸點(diǎn)大致確定2個(gè)變量的優(yōu)化值范圍，對(duì)式(1)求3個(gè)變量的一階偏導(dǎo)，得出優(yōu)化值依次為：糖蜜濃度1.28%、酵母粉濃度0.058%、FeSO4濃度0.0019%。因此，確定激活體系組分為：糖蜜1.28%、NaNO30.25%、酵母粉0.058%、FeSO40.0019%、MnSO4·H2O 0.0001%。

2.6 驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)

對(duì)所得激活體系優(yōu)化結(jié)果進(jìn)行驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，激活培養(yǎng)至第4 d時(shí)，菌濃達(dá)2×108CFU·mL-1，且有害菌的數(shù)量得到有效抑制；表面張力降至50 mN·m-1以下；產(chǎn)氣量最高達(dá)103 mL，較未添加激活體系時(shí)的產(chǎn)氣量大幅提高，說(shuō)明這個(gè)區(qū)塊具有較大的內(nèi)源微生物驅(qū)油潛力。

3 結(jié)論

在已知靖安五里灣一區(qū)理化條件的基礎(chǔ)上，利用試劑瓶法對(duì)其內(nèi)源微生物的群落結(jié)構(gòu)進(jìn)行了普查，并針對(duì)該區(qū)塊篩選出了一套激活體系，對(duì)其內(nèi)源微生物驅(qū)油潛力進(jìn)行了評(píng)價(jià)，研究表明：

1)靖安油田五里灣一區(qū)10口油井的油藏中含有不同類型且數(shù)量較多的有益微生物。

2)通過(guò)營(yíng)養(yǎng)成分的篩選及優(yōu)化單因素實(shí)驗(yàn)，確定了適合該區(qū)塊的碳源糖蜜、氮源NaNO3、磷源酵母粉，并對(duì)其濃度進(jìn)行了初步的優(yōu)化。

3)采用PB實(shí)驗(yàn)、最陡爬坡實(shí)驗(yàn)和響應(yīng)面法對(duì)影響產(chǎn)氣量的主要因素進(jìn)行了優(yōu)化，確定最佳激活體系為：糖蜜1.28%、NaNO30.25%、酵母粉0.058%、FeSO40.0019%、MnSO4·H2O 0.0001%。該激活體系能夠很好地激活油藏中的內(nèi)源微生物，激活后菌濃和產(chǎn)氣量都有大幅度的增加，表面張力顯著降低，有害菌得到有效抑制。說(shuō)明靖安油田五里灣一區(qū)油藏具有較大的內(nèi)源微生物驅(qū)油的潛力。

圖4 激活體系中產(chǎn)氣量的響應(yīng)面和等高線圖Fig.4 Response surfaces and contour lines for gas production of stimulation system

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