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        雙酶法小米黃酒釀造新工藝研究

        2014-03-27 08:10:22王正元尚小利侯銀臣
        關(guān)鍵詞:糖化酶酒精度黃酒

        王正元,惠 明*,尚小利,田 青,侯銀臣

        (1.河南工業(yè)大學(xué) 生物工程學(xué)院,河南 鄭州 450001;2.鄭州市中食農(nóng)產(chǎn)品加工研究院,河南 鄭州 450001)

        0 引言

        小米是我國主要谷物食糧之一,種植面積和產(chǎn)量均居世界首位.小米中富含人體所需的多種營養(yǎng)成分,其蛋白質(zhì)、脂肪、維生素和礦物質(zhì)含量均高于大米和玉米[1],且各組分比例適中,易于消化.黃酒主要是以稻米為原料,釀造而成的酒性醇和、酒精度低、營養(yǎng)豐富的原汁酒,是國家提倡發(fā)展的飲料酒之一[2].以小米為黃酒釀造原料,增加了小米資源的利用開發(fā).目前,大多數(shù)黃酒企業(yè)仍采用傳統(tǒng)的釀造工藝,成品酒批次間質(zhì)量不穩(wěn)定等因素嚴(yán)重影響了黃酒產(chǎn)業(yè)的發(fā)展[3].筆者采用α-淀粉酶、糖化酶進(jìn)行蒸煮后小米淀粉的液化和糖化代替?zhèn)鹘y(tǒng)釀造工藝中不穩(wěn)定的拌曲階段,可明顯縮短發(fā)酵周期,減少發(fā)酵階段的雜菌生長,降低成品酒批次間的不穩(wěn)定因素.

        1 材料與方法

        1.1 材料

        釀酒酵母:安琪釀酒活性干酵母;小米:市售;α-淀粉酶:北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司,固體,3 700 U/g;糖化酶:北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司,固體,10 000 U/g;3,5-二硝基水楊酸:國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司,化學(xué)純.

        1.2 主要設(shè)備

        723N 可見光分光光度計、PHS-3E 型pH 計:上海精密科學(xué)儀器有限公司;HH-4 型數(shù)顯恒溫水浴鍋:河南智誠科技發(fā)展有限公司;SW-CJ-1G 型單人凈化工作臺:蘇州凈化設(shè)備有限公司;THZ-300C 恒溫培養(yǎng)搖床、DHP-9052 型電熱恒溫培養(yǎng)箱:上海一恒科技有限公司;酒精度計:北京石景山玻璃儀器廠.

        1.3 工藝流程

        洗米→浸米→蒸煮→α-淀粉酶液化→糖化酶糖化→發(fā)酵→壓榨過濾→殺菌→灌裝→殺菌→成品.

        1.4 測定方法

        還原糖的測定:3,5-二硝基水楊酸比色定糖(DNS)法[4].

        總酸的測定[5]:酸堿滴定法,指示劑為酚酞.

        酒精度的測定方法[6]:容量法.

        干基的測定[7]:直接恒質(zhì)量法.

        1.5 工藝操作要點(diǎn)及試驗(yàn)設(shè)計

        1.5.1 浸米[8]與蒸飯[9]

        小米浸泡24 h,浸米溫度為20.0 ℃.蒸煮前,先將空甑蒸5~6 min,然后傾入浸泡過的小米,待冒汽后,加蓋蒸煮,開始計算蒸米時間.

        1.5.2 液化條件的選擇

        稱取定量的蒸煮過的小米,按20 U/g 加入α-淀粉酶(酶活力3 700 U/g),混合均勻,每隔40 min 取樣測定還原糖含量,以確定最佳液化時間.

        按8、16、24、32、40 U/g 的添加量添加α-淀粉酶,在最佳液化時間時取樣檢測還原糖的含量以確定最佳酶添加量.

        將蒸煮過的小米分別在75 ℃、80 ℃、85 ℃、90 ℃下保溫后,添加α-淀粉酶以考察溫度對液化液還原糖含量的影響.

        將蒸煮后的小米保溫至最佳液化溫度,用HCl和NaOH 分別調(diào)整pH 值為3、4、5、6、7,添加α-淀粉酶混合均勻,檢測還原糖含量以確定最佳液化pH 值.

        1.5.3 糖化條件的選擇

        按照最佳液化條件液化結(jié)束后,添加適量的糖化酶在65 ℃條件下糖化35 h,每隔5 h 取樣一次,并測定其還原糖含量,確定最佳糖化時間.

        按110、130、150、170、190 U/g 的酶添加量往液化后的小米中添加糖化酶(酶活力10 000 U/g),考察糖化酶添加量對糖化結(jié)果的影響.

        取樣分別保溫至50、55、60、65、70 ℃后,添加糖化酶以考察溫度對糖化結(jié)果的影響.

        用HCl 和NaOH 將pH 值調(diào)整為3、4、5、6、7,添加糖化酶并混勻,通過檢測還原糖含量確定最佳糖化pH 值.

        1.5.4 酒母的制備

        將小米糖化后過濾,取其濾液分裝于三角瓶中,加入鹽酸調(diào)pH 至4.5,蒸汽滅菌20 min,冷卻至28 ℃,用于活性干酵母活化,活化時間為15 min.

        1.5.5 發(fā)酵條件的優(yōu)化

        采用單因素試驗(yàn)的方法分別考察發(fā)酵時間、發(fā)酵溫度,活性干酵母添加量和蒸米時間對發(fā)酵完成后壓榨過濾的濾液中還原糖含量、總酸含量、酒精度的影響,然后采用正交試驗(yàn)設(shè)計法進(jìn)行發(fā)酵條件的優(yōu)化.

        2 結(jié)果與分析

        2.1 小米淀粉液化糖化工藝條件的確定

        由圖1 可知,在液化和糖化過程中,隨著酶解時間的延長,水解液DE 值逐漸增大,之后趨于穩(wěn)定.在小米淀粉液化和糖化過程中,液化180 min和糖化25 h 內(nèi),酶解液DE 值增加較快,之后增加緩慢趨于穩(wěn)定.為了節(jié)約時間以提高效率,確定液化時間為180 min,此時液化DE 值為18.61%;糖化時間為25 h,此時糖化DE 值為43.01%.

        圖1 液化時間對小米液化和糖化的影響

        由圖2 可知,隨著α-淀粉酶和糖化酶添加量的增加,DE 值迅速升高;但當(dāng)α-淀粉酶添加量大于32 U/g,糖化酶添加量大于150 U/g 時,DE 值基本趨于穩(wěn)定.這是由于加酶量較小時,底物質(zhì)量濃度大于酶的質(zhì)量濃度,加酶量對反應(yīng)速率的影響較大,DE 值隨著加酶量的增加而快速增大;隨著加酶濃度逐漸增大,酶促反應(yīng)速率受底物濃度的制約,致使水解液DE 值基本不變.考慮到成本因素,32 U/g 為α-淀粉酶較優(yōu)的加酶量,150 U/g 為糖化酶較優(yōu)的加酶量.

        圖2 酶添加量對小米液化和糖化的影響

        由圖3 可知,水解液DE 值隨溫度升高先增大后減少,液化溫度為80 ℃時液化液DE 值最大,可達(dá)17.38%;糖化溫度為60 ℃時最終糖化液DE 值最高,可達(dá)45.6%.酶解溫度同時影響酶促反應(yīng)速率和酶的活性,當(dāng)溫度較低時,隨酶解溫度的升高,酶促反應(yīng)速率加快;而當(dāng)溫度超過最適溫度時,隨溫度的繼續(xù)升高,酶變性失活,酶促反應(yīng)速率迅速下降.因此,液化的較優(yōu)溫度在80 ℃左右,糖化的較優(yōu)溫度在60 ℃左右.

        由圖4 可知,水解液DE 值隨著pH 值的增大而先升高后降低,液化和糖化階段最適pH 值都在6 左右,即蒸煮后小米在自然狀態(tài)下酶解液DE 值最大,液化時DE 值達(dá)到16.81%,糖化時DE 值達(dá)到39.6%.pH 值會影響極性基團(tuán)和酶分子構(gòu)象的穩(wěn)定性,從而影響酶分子中活性基團(tuán)的構(gòu)象以及與底物的結(jié)合力和催化能力.α-淀粉酶和糖化酶在最適作用pH 值范圍內(nèi)才能很好地發(fā)揮作用.水解液過堿或過酸都會影響其穩(wěn)定性,導(dǎo)致酶活性降低,影響酶解速率.

        圖3 溫度對小米液化和糖化的影響

        圖4 pH 對小米液化和糖化的影響

        2.2 發(fā)酵工藝參數(shù)的確定

        2.2.1 發(fā)酵過程單因素試驗(yàn)結(jié)果與分析

        由圖5 可知,隨蒸米時間的增加,發(fā)酵結(jié)束后濾液的酸度、酒精度和還原糖含量都呈現(xiàn)先增加后趨于穩(wěn)定的趨勢.蒸米時間過短,則造成液化糖化后還原糖含量低,影響后續(xù)酵母的繁殖,蒸米時間過長則造成能源資源的浪費(fèi),因此確定小米的蒸煮時間為40 min.

        圖5 蒸米時間對酒質(zhì)的影響

        由圖6 可知,發(fā)酵溫度過高,發(fā)酵結(jié)束時,其濾液的總酸含量較高,當(dāng)發(fā)酵溫度為32 ℃,濾液的總酸含量為0.6 g/100 mL.發(fā)酵溫度較低時,酵母新陳代謝減慢,增殖緩慢,酵母消耗還原糖和產(chǎn)酒精量較少.因此,確定發(fā)酵溫度為28 ℃.

        圖6 發(fā)酵溫度對酒質(zhì)的影響

        由圖7 可知,隨發(fā)酵時間的延長,在4 d 內(nèi)濾液中的總酸含量和酒精度都增加較快,當(dāng)發(fā)酵時間為5 d 時,酒精度含量有所降低,總酸含量增加.從黃酒酒質(zhì)要求酒精度較高、酸度和還原糖含量適宜的角度,確定黃酒發(fā)酵時間為4 d.

        圖7 發(fā)酵時間對酒質(zhì)的影響

        由圖8 可知,酵母添加量較少時,發(fā)酵緩慢,濾液中酒精度較低,隨酵母添加量的增加,濾液中酒精含量逐漸增高,從圖8 可知,當(dāng)酵母添加量超過0.2‰,由于酵母添加量較多,其繁殖消耗的還原糖含量增加,造成還原糖轉(zhuǎn)化為酒精含量減少,所以酒精度有所降低.因此,確定活性干酵母的添加量為0.2‰.

        2.2.2 發(fā)酵條件的優(yōu)化(表1、表2)

        試驗(yàn)表明:影響黃酒發(fā)酵質(zhì)量的主要因素是發(fā)酵溫度和發(fā)酵時間.各因素對還原糖含量影響的主次順序?yàn)椋篈>B>D>C;各因素對總酸含量影響的主次順序?yàn)椋築>A>D>C;各因素對酒精度影響的主次順序?yàn)锳>D>B>C.溫度對還原糖含量、總酸含量和酒精度的影響均顯著,發(fā)酵時間對酸度含量的影響顯著.因此,從還原糖含量、總酸含量、酒精度及節(jié)能方面考慮,確定小米黃酒的最佳工藝參數(shù)為發(fā)酵時間4 d,發(fā)酵溫度28 ℃,酵母添加量0.2‰,最佳蒸米時間40 min.

        圖8 酵母添加量對酒質(zhì)的影響

        3 結(jié)論

        在傳統(tǒng)工藝制曲拌曲過程中,若制曲不當(dāng),生曲、燒曲的現(xiàn)象可能導(dǎo)致黃酒發(fā)酵“酸敗”,拌曲時不只有糖化菌的存在還可引入其他腐敗類產(chǎn)酸菌,影響酒質(zhì)和口感[10-11].試驗(yàn)中用α-淀粉酶液化淀粉、糖化酶糖化淀粉明顯減少了雜菌的生長,同時也消除了雜菌帶給黃酒批次間的不穩(wěn)定因素.控制合適的蒸米時間,是發(fā)酵原料處理的關(guān)鍵,若蒸米時間過短,有硬心現(xiàn)象的出現(xiàn),則造成后續(xù)液化糖化階段酶解困難,從而影響后續(xù)的酵母發(fā)酵.在小米液化過程中選擇合適的溫度和酶添加量對還原糖總量的影響較為重要,糖化過程中除了選擇合適的溫度外還應(yīng)注意選擇合適的糖化時間,以滿足后續(xù)酵母的發(fā)酵所需的總還原糖含量.因此,確定蒸米時間為40 min,小米的液化時間為180 min,液化溫度為80 ℃,液化pH 為6.0,α-淀粉酶添加量為32 U/g;糖化時間為25 h,糖化溫度為60 ℃,糖化pH 為6.0,糖化酶添加量為150 U/g.在酵母發(fā)酵過程中,發(fā)酵溫度和時間是形成酒質(zhì)口感的關(guān)鍵因素,溫度過高黃酒酸敗的可能性增加,發(fā)酵時間過長也將導(dǎo)致總酸含量的增加、酒精度的降低.因此,確定最佳發(fā)酵時間為4 d,發(fā)酵溫度為28 ℃.

        表1 正交試驗(yàn)設(shè)計與結(jié)果

        表2 正交試驗(yàn)方差分析

        [1]康曉軍,王貞強(qiáng),淑英.小米黃酒中的芳香化合物[J].釀酒科技,2013(3):65-66.

        [2]劉敬科,趙巍,付會期,等.小米黃酒釀造工藝的研究[J].糧食與飼料工業(yè),2009(12):22-23.

        [3]尚小利.黍米黃酒釀造新技術(shù)及功能成分研究[D].鄭州:河南工業(yè)大學(xué),2012.

        [4]孫淑琴,邵冬梅.比色法快速測定糖化酶活力新方法[J].河北省科學(xué)院學(xué)報,1997(2):36-40.

        [5]何鳳云,朱子豐,湯麗麗.啤酒總酸測定方法的改進(jìn)[J].釀酒科技,2008(3):93-94.

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        [11]謝廣發(fā),蔡國林,張健,等.成品黃酒的污染微生物研究進(jìn)展[J].釀酒,2012(1):92-93.

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