任順成，陳雅妮

(河南工業(yè)大學 糧油食品學院，河南 鄭州 450001）

0 引言

活性自由基（如超氧陰離子自由基、羥自由基、過氧化氫等）可降解蛋白質，造成脂質過氧化以及DNA 損傷等，而這些反應與許多慢性疾病，如糖尿病、癌癥、動脈粥樣硬化、心血管疾病等密切相關[1].抗氧化劑可以抑制自由基的活性，阻斷不良反應，避免細胞遭遇氧化損傷.因此，尋求天然的抗氧化劑已成為當今科學研究的新熱點.

玉米須是我國傳統的中藥材，具有泄熱通淋，平肝利膽的功效.研究表明，玉米須含有多種生物活性成分，具有廣泛的藥理功效，其中黃酮類化合物的藥理功效尤為顯著，具有抗菌[2]、抗腫瘤、利尿、增強免疫[3]、抑制癌細胞增值、降血糖[4]、降血脂、抗氧化[5]等作用.本研究通過比較玉米須黃酮粗提物和各萃取物對自由基DPPH·、·OH 和O2-·的清除能力，旨在尋找抗氧化能力強的黃酮極性部分，為合理利用玉米須資源和開發(fā)天然抗氧化劑提供依據.

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 材料

玉米須：購于鄭州市藥材批發(fā)市場；蘆丁標準品：上海華碩精細化學品有限公司；1，1-二苯基-2-三 硝 基 苯 肼（1，1-Diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH·）：Sigma 公司；無水乙醇、甲醇、石油醚、乙酸乙酯、正丁醇、三氯化鋁、30%雙氧水、三羥甲基氨基甲烷、水楊酸、硫酸亞鐵、鄰苯三酚等均為分析純.

1.1.2 主要儀器

RE-52 旋轉蒸發(fā)器：上海亞榮生化儀器廠；SHZ-D（Ⅲ）循環(huán)水式真空泵：鞏義市予華儀器有限責任公司；UV-7504 型紫外可見分光光度計：上海欣茂儀器有限公司；電熱鼓風干燥箱：上海樹立儀器儀表有限公司；AY120 型電子分析天平：日本島津.

1.2 方法

1.2.1 樣品的制備

將除雜、晾干、剪碎的玉米須分批放入40 L 的密閉容器中，用體積分數為80%的乙醇浸泡72 h，不定期攪拌，抽濾旋蒸回收乙醇，回收的乙醇調成80%后加入到提取器中，反復3 次，合并提取液，旋蒸濃縮，干燥得紅褐色膏狀物（即黃酮粗提取物）.

將粗提物（EF）加少量蒸餾水溶解，用石油醚萃取后將萃余液分成兩部分，分別用飽和的正丁醇和乙酸乙酯反復萃取，剩余部分為水萃取物.將石油醚萃取物（PF）、正丁醇萃取物（BF）、乙酸乙酯萃取物（AF）和水萃取物（WF）分別旋轉蒸發(fā)濃縮干燥至膏狀，乙醇溶解備用.

1.2.2 樣品中總黃酮含量的測定

參照文獻[6]，以蘆丁為標準品，繪制標準曲線，得回歸方程：A=0.029 2X+0.009 4，R2=0.999 1.采用AlCl3比色法測定樣品中黃酮含量.

1.2.3 樣品液的配置

將所得樣品分別稀釋成黃酮含量為5、10、15、20、25 μg/mL 的樣品液，進行抗氧化能力量效關系的測定.

1.2.4 抗氧化活性的測定

1.2.4.1 清除DPPH·能力的測定[7-8]

分別取不同濃度的試樣液2 mL，并加入2 mL 0.2 mmol/L 的DPPH·貯備液（無水乙醇溶解），搖勻，避光靜置30 min 后，用無水乙醇做參比液，測定反應體系在517 nm 處的吸光度Ai；同時測定2 mL DPPH·溶液與等體積無水乙醇混合液的吸光度Ac及2 mL 試樣液與等體積無水乙醇混合液的吸光度Aj，每個樣品平行測定3 次.

DPPH·清除率=[1-（Ai-Aj）/Ac]×100%，

式中：Ai為DPPH·與試樣液的吸光度；Aj為試樣液與無水乙醇的吸光度；Ac為DPPH·與無水乙醇的吸光度.

1.2.4.2 清除羥自由基（·OH）能力的測定[9-11]

分別取不同濃度的試樣液2 mL，加入6 mmol/L FeSO40.5 mL、1.5 mmol/L 水楊酸-乙醇溶液2 mL，再加入0.1%的H2O2溶液0.5 mL，于37 ℃啟動反應，反應15 min，在510 nm 下測定各反應體系的吸光度AX；蒸餾水代替雙氧水的吸光度為AX0，蒸餾水代替試樣液的吸光度為A0，每個樣品平行測定3 次.計算試樣液的清除率.

·OH 清除率=[1-（AX-AX0）/A0]×100%，

式中：A0為空白對照液的吸光度；AX為加入黃酮溶液后的吸光度；AX0為不加H2O2溶液本底吸光度.

1.2.4.3 清除超氧陰離子自由基（O2-·）能力的測定[12]

取4.5 mL pH 8.2、0.05 mol/L Tris-HCl 緩沖液，4.2 mL 蒸餾水，混勻后在25 ℃水浴中保溫20 min，取出后立即加入在25 ℃預熱過的3 mmol/L的鄰苯三酚0.3 mL（空白管用蒸餾水代替鄰苯三酚溶液），迅速搖勻后倒入比色杯，325 nm 下每隔30 s 測定吸光度，在線性范圍內計算每分鐘吸光度的增加速率即鄰苯三酚的自氧化速率.在加入鄰苯三酚前，先加入0.5 mL 的試樣液，蒸餾水減少，然后按上述方法計算抑制率.

抑制率=[（ΔA0-ΔA）/ΔA0]×100%，

式中：ΔA0為鄰苯三酚的自氧化法速率；ΔA 為加入黃酮溶液后鄰苯三酚自氧化法速率.

1.2.4.4 還原力的測定

取2.5 mL 0.2 mol/L 磷酸緩沖溶液（pH 6.6）及2.5 mL1%鐵氰化鉀，加入1 mL 不同濃度的試樣液，50 ℃水浴20 min 后快速冷卻，加入2.5 mL 10%三氯乙酸溶液，混勻后于3 000 r/min 離心10 min，取上清液2.5 mL，加入2.5 mL 蒸餾水及0.5 mL 0.1% FeCl3溶液，混勻后靜置10 min 于700 nm 處測定吸光值.吸光值的大小表示還原力的強弱.

2 結果與分析

2.1 玉米須黃酮不同極性萃取物得率

樣品按1.2.1 萃取，得率見表1.

表1 玉米須不同極性萃取物得率

由表1 可知，玉米須粗提物得率高達50%以上，經不同極性溶劑萃取后，所得萃取物含量相差較大，玉米須提取物中水溶性部分含量最高，其次為正丁醇相和乙酸乙酯相，石油醚萃取物含量最低，可見玉米須提取物中脂溶性成分含量很少.

2.2 玉米須不同極性萃取物黃酮含量

由表2 可見，玉米須不同萃取物中，乙酸乙酯萃取物和正丁醇萃取物中黃酮含量相對較高，而石油醚萃取物中黃酮最低，由此可以推測，玉米須中的黃酮類型以中極性為主.

2.3 玉米須黃酮不同極性萃取物清除自由基（DPPH·）的能力

DPPH·是一種穩(wěn)定的有機自由基，能夠與一個電子或氫自由基形成一個穩(wěn)定的抗磁性分子態(tài)，通過使用順磁共振儀檢測自由基信號來表示其抗氧化性的強弱，但是此方法難以普及[7，13].利用分光光度法測定清除DPPH·的能力應用較廣泛，當有供氫能力的抗氧化劑存在時，DPPH·的乙醇溶液由深紫色變淺，吸光度值變小.根據吸光度的變化可測得抗氧化物的活性[14].

表2 玉米須不同極性萃取物黃酮含量

如圖1 所示，玉米須黃酮粗提物和各萃取物對DPPH·都有較強的清除能力，并且隨黃酮類化合物濃度的增加而增強.清除DPPH·能力大小依次為：BF＞EF＞AF＞WF＞PF.BF 對DPPH·的清除能力最強，當試樣液中黃酮濃度為5 μg/mL 時，BF 的清除率為93.20%，而PF 的清除率為34.13%，與BF 的清除率存在顯著性差異（P＜0.01），并且明顯低于其他萃取成分.當試樣液中黃酮濃度為25 μg/mL 時，BF 的清除率高達99.35%，PF 也表現出較強的清除能力，清除率高達88.17%，與其他萃取物的差異性降低.各萃取物表現出不同的清除能力，這可能是由于玉米須不同極性萃取物中所含黃酮類化合物的種類和結構不同，也可能含有其他抗氧化成分，因此對DPPH·的清除能力有所差異，進而表現出了不同的抗氧化活性.EF 的清除率低于BF，可能因為粗提物中含有較多的雜質所致.

圖1 玉米須黃酮粗提物和各萃取物對DPPH·的清除作用

2.4 玉米須黃酮不同極性萃取物清除羥自由基（·OH）的能力

過氧化氫是一種非活性成分，廣泛存在于生物體和食物中，當體系中存在還原性金屬離子時，過氧化氫就會釋放出氧化能力很強的羥自由基（·OH）[15].·OH 能夠氧化有機體的多種物質，造成人體組織中脂質的過氧化、核酸的斷裂、多糖和蛋白質的分解，從而導致機體受損和基因突變，引起機體衰老和癌變[16].根據Fenton 反應原理，H2O2遇Fe2+釋放出·OH，水楊酸與·OH 反應生成有色物質，在λ=510 nm 處有最大吸收峰，當反應體系中存在能清除·OH 的成分時，就會與水楊酸競爭·OH，使有色產物生成量減少，吸光度也相應變小.根據吸光度的變化值測定不同濃度試樣液對·OH 的清除能力.

如圖2 所示，各試樣液對·OH 的清除率隨其黃酮濃度的增加而增強，且呈現出不同的增長趨勢，清除·OH 能力大小依次為：BF＞AF＞EF＞PF＞WF，這可能是由于不同極性萃取物中所含黃酮類化合物的種類及含量不同，其清除·OH 的能力大小也不同.AF 和BF 與其他萃取物相比表現出了較強的清除力，這也可能是由于萃取部分中含有抗氧化能力較強的多酚類化合物，國內外已有眾多研究表明多酚具有較強的抗氧化活性.當試樣液中黃酮濃度為25 μg/mL 時，對·OH 的清除力最高為75.84%，明顯弱于對DPPH·和O2-·的清除能力.

圖2 玉米須黃酮粗提物和各萃取物對·OH 的清除作用

2.5 玉米須黃酮不同極性萃取物清除超氧陰離子 自由基（O2-·）的能力

超氧陰離子自由基是生命體代謝過程中產生的一種氧化能力較強的自由基，在機體中存在壽命最長.鄰苯三酚在一定條件下可迅速氧化產生O2-·，O2-·作為單電子氧化劑迅速與鄰苯三酚作用,使其進一步氧化,生成一系列復雜的激發(fā)態(tài)氧化產物,溶液由無色逐漸變成深黃色，在λ=325 nm 處有最大吸收峰[17].當反應中存在抗氧化劑時，就會抑制鄰苯三酚的自氧化速率，使其吸光度值的變化速率減小.由吸光度的變化速率反映出玉米須黃酮粗提物和各萃取物對O2-·的清除能力.

如圖3 所示，在相同的濃度下，乙酸乙酯萃取物對O2-·的清除力最強，其次是正丁醇萃取物、粗提物、水萃取物，而石油醚萃取物最弱.各萃取物對O2-·的清除力與黃酮含量且呈顯著的量效關系，相關系數分別為0.937 0、0.927 9、0.975 1、0.989 0、0.993 4.當試樣液中黃酮濃度為25 μg/mL時，AF、BF、EF、WF、PF 的清除率分別為94.27%、91.22%、85.03%、71.12%、68.70%，AF 的清除率高于其他萃取物，這可能是因為AF 中的黃酮類化合物對O2-·有較強的清除活性.

2.6 玉米須黃酮不同極性萃取物還原力的測定

由圖4 可知，還原能力隨著樣液中黃酮濃度的增加呈線性上升趨勢，還原力與黃酮濃度的線性相關系數分別為0.954 5（EF）、0.888 3（PF）、0.977 1（AF）、0.957 1（BF）、0.998 7（WF）.黃酮濃度為25 μg/mL 時，EF、PF、AF、BF 和WF 的吸光值分別為1.517、0.491、1.528、1.576、1.439，提取物還原力的大小排序為BF＞AF＞EF＞WF＞PF.還原力越強表明抗氧化能力越強，因此，還原力的強弱表明了各萃取物的抗氧化活性的大小，由此可知正丁醇萃取物和乙酸乙酯萃取物具有較強的抗氧化活性.

圖3 玉米須黃酮粗提物和各萃取物對O2-·的清除作用

圖4 玉米須黃酮粗提物和各萃取物的還原力

3 結論

玉米須黃酮粗提物、石油醚萃取物、正丁醇萃取物、乙酸乙酯萃取物和水萃取物均有較強的還原能力并且能有效地清除DPPH·、·OH、O2-·，具有較強的抗氧化活性，且呈現出顯著的量效關系.不同萃取物在各反應體系中的抗氧化活性也各不相同，其中正丁醇萃取物的還原力和對DPPH·、·OH的清除能力最強，而乙酸乙酯萃取物對O2-·的清除作用最強.當黃酮濃度為25 μg/mL 時，萃取物對DPPH·、·OH、O2-·3 種自由基均表現出較強的清除作用，清除率分別高達：99.35%、75.84%、94.27%.正丁醇萃取物和乙酸乙酯萃取物的還原力和抗氧化活性相對較強，且萃取得率高，并預示其具有強大的保健功效，因此可以做進一步的研究，分離純化出有效的活性成分，開發(fā)出一種天然高效的抗氧化劑.

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