吳梅芬，王曉崗，許新華

(同濟(jì)大學(xué) 化學(xué)系，上海 200092)

酶催化反應(yīng)動(dòng)力學(xué)是生物化學(xué)和物理化學(xué)反應(yīng)動(dòng)力學(xué)的重要內(nèi)容[1-3]。酶催化反應(yīng)機(jī)理與均相(多相)催化反應(yīng)機(jī)理有顯著差別，通過實(shí)驗(yàn)比較兩類反應(yīng)動(dòng)力學(xué)行為的差異，對學(xué)生掌握化學(xué)反應(yīng)動(dòng)力學(xué)基本理論和方法非常有益。蔗糖轉(zhuǎn)化反應(yīng)實(shí)驗(yàn)是經(jīng)典的化學(xué)反應(yīng)動(dòng)力學(xué)實(shí)驗(yàn)之一。該反應(yīng)可以用酸均相催化完成，也可以用蔗糖酶催化完成。在實(shí)驗(yàn)教學(xué)中，前者常采用測定溶液旋光度的方法，連續(xù)測定反應(yīng)的動(dòng)力學(xué)曲線，是典型的物理化學(xué)實(shí)驗(yàn)方法[4-5]；后者則采用化學(xué)淬滅法終止反應(yīng)，取樣分析獲得初始反應(yīng)速率值，是典型的生物化學(xué)實(shí)驗(yàn)方法[6-7]。由于實(shí)驗(yàn)方法的差異性，學(xué)生在進(jìn)行這兩類實(shí)驗(yàn)時(shí)很難相互比較，無法將兩者有機(jī)聯(lián)系起來，因而不能完整理解和掌握化學(xué)反應(yīng)動(dòng)力學(xué)的相關(guān)理論。

1 實(shí)驗(yàn)原理

本文研究開發(fā)了一種新的蔗糖酶催化蔗糖轉(zhuǎn)化反應(yīng)的實(shí)驗(yàn)體系，采用與均相酸催化蔗糖轉(zhuǎn)化反應(yīng)完全相同的實(shí)驗(yàn)技術(shù)和實(shí)驗(yàn)方法，連續(xù)測量蔗糖溶液在蔗糖酶催化作用下的旋光度的變化，通過數(shù)據(jù)擬合推算反應(yīng)的初始速率，然后用米氏方程求算相關(guān)酶促反應(yīng)參數(shù)。

根據(jù)化學(xué)反應(yīng)動(dòng)力學(xué)理論，酶催化反應(yīng)機(jī)理是Michaelis和Menten應(yīng)用酶反應(yīng)過程中形成中間絡(luò)合物的學(xué)說導(dǎo)出的米氏方程[8-9]。蔗糖酶(E)與底物蔗糖(S)先形成中間化合物(ES)，然后中間化合物再進(jìn)一步分解為產(chǎn)物葡萄糖(G)和果糖(F)，并釋放出酶(E)。機(jī)理如下：

(1)

當(dāng)反應(yīng)溫度和酶的總濃度確定時(shí)，酶促反應(yīng)速率可以表示為

(2)

式中KM為米氏常數(shù)，rm為最大速率，該方程稱為米氏方程。

采用旋光度法測定反應(yīng)體系中蔗糖濃度時(shí)，反應(yīng)體系的旋光度與蔗糖濃度的關(guān)系為

(3)

(4)

積分后得到

(5)

從原理上說，按上式直接擬合實(shí)驗(yàn)測定的t-θ數(shù)據(jù)就可以得到酶促反應(yīng)參數(shù)KM和rm。但是，由于實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的不完備性、波動(dòng)性以及酶制劑的質(zhì)量問題，t-θ關(guān)系式中的擬合參數(shù)可能無法與上式中相關(guān)項(xiàng)的定義一一對應(yīng)。一般地，可以把實(shí)驗(yàn)測定的t-θ關(guān)系表達(dá)為如下的普遍形式：

t=A(1-θ)-Blnθ

(6)

經(jīng)過數(shù)據(jù)擬合，可以得到擬合參數(shù)A、B，并計(jì)算出蔗糖初始濃度為cS0時(shí)的初始反應(yīng)速率為

(7)

實(shí)驗(yàn)時(shí)，配制一系列不同初始濃度cS0的蔗糖溶液，并測得其α0和α∞。在相同實(shí)驗(yàn)溫度和酶濃度條件下，分別測定每個(gè)溶液的反應(yīng)時(shí)間t和旋光度αt數(shù)據(jù)，并計(jì)算出θ值。擬合t-θ關(guān)系得到擬合參數(shù)A、B，并計(jì)算每個(gè)溶液的初始反應(yīng)速率r0，由此得到一系列cS0-r0數(shù)據(jù)，代入米氏方程中。根據(jù)Hanes-Woolf作圖法[10-11]，米氏方程可以變形為

(8)

該實(shí)驗(yàn)方法簡便、實(shí)用，物理化學(xué)概念清晰明了，實(shí)驗(yàn)技術(shù)也是學(xué)生熟練掌握的旋光度測定法，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)與酸催化蔗糖轉(zhuǎn)化反應(yīng)的實(shí)驗(yàn)結(jié)果對照性很強(qiáng)，有助于學(xué)生通過對比更好地理解掌握酶催化反應(yīng)的特點(diǎn)和規(guī)律。

2 實(shí)驗(yàn)

2.1 實(shí)驗(yàn)儀器及試劑

電子天平、恒溫水浴、錐形瓶(100 mL)、移液管(5 mL、10 mL、25mL)、pH計(jì)、離心機(jī)、離心管、超級恒溫槽、旋光儀、旋光管(帶夾套)、玻璃漏斗、定性濾紙、烘箱、鮮酵母、蔗糖(A.R.)、果糖(A.R.)、葡萄糖(A.R.)、醋酸鈉(A.R.)、甲苯(A.R.)、醋酸(A.R.)、具塞碘量瓶(100 mL)、

2.2 實(shí)驗(yàn)步驟

(1) 蔗糖酶的制取[12]：取鮮酵母20 g于100 mL三角瓶中，加入1.6 g醋酸鈉，攪拌15～20 min后使團(tuán)塊液化，再加3 mL甲苯，混和后搖動(dòng)10 min，放在恒溫水浴中37 ℃保溫60 h左右；取出后加入3.2 mL、4 mol/dm3的醋酸和100 mL水，使pH值在4.5左右；將混合物以3 000 r/min的速度離心30 min，離心后形成3層，取中層的黃色液體；再以同樣速度離心30 min，所得澄清的黃色液體即為蔗糖酶粗品；將此蔗糖酶用pH=4.6的緩沖溶液稀釋10倍，過濾后冷凍保存。

(4) 蔗糖酶催化過程中不同蔗糖濃度體系的旋光度變化值測定：取0.6 mol/dm3的蔗糖25 mL溶液于50 mL容量瓶中，再加入22 mL、pH=4.6的緩沖溶液，加入10 mL自制粗蔗糖酶，再稀釋至刻度線，得到蔗糖濃度為0.3 mol/dm3的蔗糖酶催化反應(yīng)溶液；移入帶夾套旋光管，在35 ℃恒溫條件下測定溶液旋光度隨時(shí)間t的變化t；然后采用同樣的方法，分別取0.6 mol/dm3的蔗糖溶液12.5 mL、10 mL、7 mL、5 mL和4 mL，配制得到濃度為0.048～0.15 mol/dm3的蔗糖酶蔗糖反應(yīng)液，并分別測定其t。

2.3 數(shù)據(jù)記錄與處理

(1) 蔗糖溶液濃度cs與0、關(guān)系。采用蔗糖配制一系列標(biāo)準(zhǔn)溶液，并測定其旋光度0；采用葡萄糖與果糖配制成1∶1的一系列標(biāo)準(zhǔn)濃度，并測定其旋光度，并將濃度與對應(yīng)的旋光度作圖，得到直線的線性很好結(jié)果，如圖1所示。

圖1 蔗糖溶液濃度cs與0、值關(guān)系曲線(35 ℃)

(2) 在35 ℃恒溫下測定0.3 mol/dm3的蔗糖溶液在蔗糖酶作用下，溶液的t～t的關(guān)系數(shù)據(jù)。以θ為橫坐標(biāo)，t為縱坐標(biāo)作圖，用Origin軟件按方程(6)作非線性擬合，得到擬合參數(shù)A、B值(見圖2)。

圖2 蔗糖酶催化過程中旋光度隨時(shí)間變化關(guān)系

按同樣方法作圖計(jì)算得到一系列不同蔗糖初始濃度cs0對應(yīng)的A、B值，并列于表1中。按方程(7)計(jì)算每個(gè)cs0對應(yīng)的初始反應(yīng)速率r0值。

表1 不同初始濃度蔗糖溶液的初始反應(yīng)速率及擬合參數(shù)

將上述數(shù)據(jù)采用式(8)擬合直線，直線斜率為1/rm，在縱軸上截距為KM/rm，直線延伸于橫軸交點(diǎn)為KM(見圖3)。實(shí)驗(yàn)測得35 ℃時(shí)本實(shí)驗(yàn)使用的粗制蔗糖酶的米氏常數(shù)KM=0.029 mol/dm3，最大速率rm=1.3010-4mol/(dm3·s)，與文獻(xiàn)值相符[12-13]。

圖3 Hanes-Woolf作圖法計(jì)算米氏常數(shù)

3 結(jié)果與討論

本實(shí)驗(yàn)采用旋光儀對酶催化蔗糖轉(zhuǎn)化反應(yīng)體系中溶液的旋光度進(jìn)行連續(xù)測定，使用的實(shí)驗(yàn)儀器與方法同酸催化蔗糖轉(zhuǎn)化反應(yīng)實(shí)驗(yàn)類似，有利于學(xué)生將傳統(tǒng)物理化學(xué)實(shí)驗(yàn)與生物化學(xué)實(shí)驗(yàn)的概念、方法和技術(shù)進(jìn)行對比，加深對酶催化反應(yīng)特點(diǎn)的認(rèn)識。本實(shí)驗(yàn)適用于粗制蔗糖酶作為催化劑的酶催化反應(yīng)動(dòng)力學(xué)研究，所采用的數(shù)據(jù)處理方法能夠有效消除干擾因素(如：酶制劑不純等)對實(shí)驗(yàn)結(jié)果的影響，使用常規(guī)的物理化學(xué)儀器，用比較嚴(yán)密的實(shí)驗(yàn)方法獲得酶催化反應(yīng)的初始反應(yīng)速率數(shù)據(jù)，比較正確地描述了酶催化反應(yīng)動(dòng)力學(xué)方程，并得到了與文獻(xiàn)報(bào)道相近的動(dòng)力學(xué)參數(shù)。

本實(shí)驗(yàn)方法簡便、準(zhǔn)確、適用于大規(guī)模本科生物理化學(xué)實(shí)驗(yàn)教學(xué)，實(shí)驗(yàn)所使用的試劑和儀器價(jià)廉、易得、安全，有效填補(bǔ)了常規(guī)物理化學(xué)實(shí)驗(yàn)中酶催化動(dòng)力學(xué)實(shí)驗(yàn)項(xiàng)目的缺失，使學(xué)生獲得更全面的物理化學(xué)實(shí)驗(yàn)訓(xùn)練，加深對物理化學(xué)基本原理和方法的理解和掌握。該實(shí)驗(yàn)體系在我校化學(xué)、材料等專業(yè)的實(shí)驗(yàn)教學(xué)中取得了良好的教學(xué)效果。

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