榮良燕，姚拓，馬文彬，李德明，李儒仁，張潔，陸颯

（1.甘肅農(nóng)業(yè)大學草業(yè)學院，甘肅 蘭州730070；2.甘肅農(nóng)業(yè)大學草業(yè)生態(tài)系統(tǒng)教育部重點試驗室，甘肅 蘭州730070；3.甘肅省草原技術推廣總站，甘肅 蘭州730046；4.甘肅農(nóng)業(yè)大學食品科學與工程學院，甘肅 蘭州730070）

長期以來，為了滿足農(nóng)作物生長所需的氮、磷等營養(yǎng)元素，工業(yè)化肥一直被認為是實現(xiàn)這一目標的主要途徑。然而，隨著化肥使用量不斷增大，其負面影響日益明顯，如導致土壤結構破壞、肥力下降，造成土壤微生物區(qū)系多樣性破壞等諸多問題，并且由于生產(chǎn)化肥引起的水質、空氣污染，非再生能源的大量消耗，食品安全等問題已成為困擾農(nóng)業(yè)生產(chǎn)的主要因素［1］。近年來，隨著人們生態(tài)保護意識的增強以及對無公害農(nóng)作物生產(chǎn)的日益重視，探尋新的肥料來源（尤其是生物肥料）以替代工業(yè)化肥的研究倍受關注。

岷山紅三葉（Trifoliumpratensecv.Minshan）屬高產(chǎn)型優(yōu)質牧草，營養(yǎng)全面，再生性強，并且含有大量的異黃酮多酚化合物。研究資料表明，異黃酮具有較強的清除自由基能力，岷山紅三葉中可提取的異黃酮含量（1.0%～2.6%）遠高于大豆異黃酮（0.1%～0.3%）［2］。為了滿足紅三葉生存、生產(chǎn)所需的氮、磷等營養(yǎng)元素，大量化學肥料被用于紅三葉以獲得較高產(chǎn)量。然而，在經(jīng)濟落后、土壤貧瘠的地區(qū)，大量使用化肥不但增加了農(nóng)業(yè)生產(chǎn)成本，而且造成了環(huán)境及食品污染，同時隨著化肥施用量的增加，出現(xiàn)了肥效降低、利用率下降等現(xiàn)象。因此，探尋新的生物生態(tài)肥源，以實現(xiàn)對工業(yè)化肥的部分替代或完全替代的目標已迫在眉睫。

植物根際促生菌（plant growth promoting rhizobacteria，PGPR）是存在于植物根際或根表，可以促進植物生長或拮抗病原菌的微生物。PGPR不僅可以分泌植物促生物質（如植物激素、維生素、氨基酸、其他活性有機小分子衍生物等），還可以改善植物根際的營養(yǎng)環(huán)境（如PGPR在植物根際的代謝作用加強了土壤中有機物的分解，促進了植物營養(yǎng)元素的礦化，增加了作物的營養(yǎng)供應）。此外，PGPR還具有控制植物病害，降解土壤污染物的作用［3－4］。利用不同環(huán)境、不同植物群落根際分離、篩選的優(yōu)良促生菌研制的生物菌肥不僅具有以上優(yōu)點，還可以減少生產(chǎn)和使用農(nóng)藥、化肥帶來的環(huán)境和食品污染及非再生能源消耗。因此，土壤微生物資源的定向利用已成為現(xiàn)代農(nóng)業(yè)科技領域的研究熱點之一。

目前，國內外學者已經(jīng)研究出了可用于水稻（Oryzasativa）［5］、小麥（Triticumaestivum）［6］、玉米（Zea mays）［7］、番茄（Lycopersiconesculentum）［8］、櫻桃（Prunusavium）［9］等作物的微生物肥料，并且取得了良好的效果，但關于PGPR微生物肥料應用于岷山紅三葉的研究報道很少。隨著西部生態(tài)環(huán)境建設和農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)結構調整的不斷推進，岷山紅三葉的種植面積逐年擴大，其產(chǎn)業(yè)化功能在優(yōu)質高效農(nóng)業(yè)發(fā)展中發(fā)揮著重要作用。因此，選擇和評價適宜的岷山紅三葉微生物菌肥并將其推廣使用具有重要意義。本研究從適宜岷山紅三葉生長的環(huán)境中分離篩選根際優(yōu)良促生菌，以制備有利于促生、防病綜合功能的環(huán)保型復合根際菌肥，并研究用其部分替代化肥后對岷山紅三葉生長及營養(yǎng)品質的影響，為微生物肥源部分替代化肥以減少購買性投入量，實現(xiàn)微生物資源定向利用提供理論依據(jù)和技術支撐。

1 材料與方法

1.1 材料

采樣地位于甘肅岷縣岷山紅三葉種植基地，選擇生長旺盛的岷山紅三葉植株，附帶根及周圍土壤，裝入無菌封口袋中，4℃保存。

1.2 岷山紅三葉根際促生菌的篩選

1.2.1 初篩 將采集到的植株抖掉附著在根上的土壤，用無菌刷子收集根表層土壤，稱取10g加入90mL無菌蒸餾水中，28℃下?lián)u床震蕩30min［10］。采用稀釋法將菌懸液逐步稀釋后涂布于PKO（Pikovaskaia’s）平板培養(yǎng)基上［10］，3～4個重復，28℃培養(yǎng)10d。觀察平板上菌落生長及菌落周圍透明圈情況，計算透明圈直徑（D）與菌落直徑（d）的比值并記錄，D/d比值越大，溶磷能力越強。挑取菌落生長飽滿，透明圈明顯的單菌落保存。

1.2.2 復選 對初篩得到的菌株進行繼代培養(yǎng)，1個月后將各菌株點接種至PKO平板上，計算D/d值，篩選出穩(wěn)定產(chǎn)生透明圈的菌株，挑取整個單菌落接種在PKO液體培養(yǎng)基中，28℃，160r/min搖床培養(yǎng)13d。4℃，10000r/min離心15min，取上清液，以未接菌的培養(yǎng)液為對照，測定發(fā)酵液的pH值，并采用鉬銻抗比色法測定菌液中有效磷增量，篩選出溶磷量較高的菌株，4℃斜面保存［11］。

1.3 促生菌株促生性能測定

對篩選出的菌株進行固氮酶活性、分泌吲哚－3－乙酸（indole－3－acctic acid，IAA）能力、拮抗病原菌能力的測定。固氮酶活性采用乙炔還原法（acelylene reduction assay，ARA）測定［7］，分泌IAA能力采用Salkowski比色法測定［11］，拮抗病原菌能力采用平板對峙法測定［12］。

1.4 岷山紅三葉根瘤菌的分離與純化

選取生長飽滿、直徑較大的根瘤，無菌水浸泡并沖洗3～5次，95%的乙醇浸泡30s，0.1%HgCl消毒5min，無菌水沖洗數(shù)次。用滅菌鑷子夾破根瘤劃線涂布在YMA（酵母甘露醇瓊脂）平板培養(yǎng)基上，28℃培養(yǎng)，待菌落長出后挑取典型菌落劃線培養(yǎng)，出現(xiàn)單菌落后4℃冰箱保存。

1.5 岷山紅三葉復合菌肥的制作

1.5.1 菌株懸浮液及菌肥的制作 分別接種各優(yōu)良PGPR菌株于50mL LB（Luria－Bertani，溶菌肉湯）液體培養(yǎng)基中，28℃，125r/min培養(yǎng)48h。待菌株充分生長后，用無菌水調節(jié)各菌株菌懸液濃度為1×108cfu/mL（波長660nm，OD值≥0.5）。300mL三角瓶內裝入100mL LB液體培養(yǎng)基，滅菌后置于室溫下1～2d，經(jīng)檢查無污染后分別接種20mL上述各菌懸液，于28℃，125r/min培養(yǎng)2～3d，將菌液注入滅菌玻璃瓶中常溫密封保存?zhèn)溆谩８鼍臃N于YMA液體培養(yǎng)基中，其他方法同PGPR菌肥制作方法。

1.5.2 根際復合菌肥的制作 根際復合菌肥的制作參考韓華雯等［13］的方法。取PGPR菌和根瘤菌發(fā)酵液于室溫下1～2h，無菌環(huán)境下，將兩者按一定比例混合即可（菌株種類和比例正在申報專利）。

1.5.3 復合微生物菌肥的質檢 采用平板計數(shù)法和顯微觀察計數(shù)法，具體方法參考《農(nóng)用微生物菌劑》質量標準［14］。在儲藏15，30，60，90，120，150，180，210，240，270d各檢查一次，同時觀察菌肥是否有霉變、異味等產(chǎn)生，若有效活菌數(shù)達1×108cfu/mL以上且無污染方可認為菌肥質量達標。

1.6 盆栽試驗設計及方法

1.6.1 試驗材料 試驗種子：岷山紅三葉由甘肅省草原技術推廣總站提供，純凈度≥94%，發(fā)芽率≥88%?；瘜W肥料：尿素（含N 46%），磷二銨（含P 46%，N 18%）。生物菌肥：岷山紅三葉根際復合促生菌肥（即1.5中制作出的復合菌肥）。

花盆直徑0.22m，深0.17m。盆栽土壤：土與營養(yǎng)土比例為2∶1，加入珍珠鹽（混合土∶珍珠巖，20∶1）和少量垤石。土壤養(yǎng)分pH 7.05，有機質含量25.8%，有效氮75.05mg/kg，有效磷12.91mg/kg，有效鉀180.29 mg/kg。

稱取混合土壤2.5kg，添加0.4g尿素，0.9g磷二銨，混勻后裝盆。選取飽滿種子50粒于2012年9月底播種，播種深度1～2mm。2013年5月中旬、8月底分兩次采集盆栽植株樣品并分別測定產(chǎn)量、品質及異黃酮含量等。

1.6.2 促生菌肥使用方法及使用量 播種前種子用菌肥拌種，置陰涼處2h，待菌肥附著在種子表面后即可播種。

1.6.3 試驗設計 試驗設4個處理、1個對照。CK：全量化肥；A：菌肥；B：25%化肥＋菌肥；C：50%化肥＋菌肥；D：75%化肥＋菌肥。每個處理重復3次。

1.6.4 測定指標 干草產(chǎn)量，收獲各處理的盆栽植株，常溫下完全風干至恒重，稱量后計算平均值。

營養(yǎng)品質測定，將岷山紅三葉青干草用錘式粉碎機粉碎，粉碎機篩孔直徑為0.6mm。粗蛋白（CP）采用凱氏定氮法測定。粗灰分（CA）采用馬弗爐（550℃）直接灰化法測定。中性洗滌纖維（NDF）和酸性洗滌纖維（ADF）分別采用Van Soest法和Roberston法測定。全磷量采用鉬銻抗比色法測定。鈣以EDTA絡合滴定法測定［15］。

異黃酮含量測定方法：采用高效液相色譜分析儀進行測試［16］。色譜條件：Lichrospher C18色譜柱（2.6mm×250mm），柱溫：30℃；檢測波長：260nm；流動相：甲醇－水－1%乙酸0～50min，15%甲醇（含1%乙酸）－80%甲醇（含1%乙酸）梯度洗脫，流速：0.3mL/min，進樣量：5μL。

1.7 數(shù)據(jù)處理

采用Excel 2010處理數(shù)據(jù)，使用SPSS 19.0進行統(tǒng)計分析，使用Origin 8.6繪圖。

2 結果與分析

2.1 根際優(yōu)良促生菌、根瘤菌及其促生特性

從岷山紅三葉根際分離出129株根際促生菌，經(jīng)過測定菌株的生長速度、溶磷量、分泌植物生長激素量和對病原菌的拮抗作用，篩選出了6株根際優(yōu)良促生菌，同時從岷山紅三葉根部分離出1株根瘤菌（表1）。6株促生菌生長速度均較快，菌株MHS7、MHS27兼具溶磷、分泌生長激素及抑制病原菌（Fusariumoxysporiumf.sp.cucumerinum、Rhizoctoniasolani、Fusariumoxysporumf.niveum）的能力；菌株MHS19具有良好的分泌植物生長激素的能力，菌株MHS30的溶磷量達到229.50 mg/L；1株根瘤菌屬于慢生型根瘤菌，其固氮酶活性達到488.20nmoL/（mL·h）。

表1 岷山紅三葉根際優(yōu)良促生菌、根瘤菌及其促生特性Table 1 Characteristics of growth promoting rhizobacteria and rhizobium from clover

2.2 菌肥質量檢查

有效活菌數(shù)及菌劑是否被雜菌污染是表征菌肥質量的重要指標。表2顯示，制作的微生物菌肥在室溫條件下，0～30d時有效活菌數(shù)呈上升趨勢，30d時最高，為20.30×108cfu/mL，之后逐漸下降，在240d時有效活菌數(shù)均在108cfu/mL以上，并且無污染，270d時，菌肥中的有效活菌數(shù)下降至0.35×108cfu/mL，且伴有雜菌污染和霉變現(xiàn)象。因此，為了保證菌肥的質量，該菌肥制作后應當在8個月內使用。該菌肥符合《微生物肥料》NY227－94標準［17］。

表2 復合微生物菌肥質量檢查Table 2 Quality check of compound microbial bacterial fertilizer

2.3 微生物菌肥對岷山紅三葉干草產(chǎn)量的影響

干草產(chǎn)量是衡量牧草生產(chǎn)能力的重要指標。從表3可以看出，不同施肥處理對岷山紅三葉第1茬干草產(chǎn)量影響差異顯著（P＜0.05）。處理D干草產(chǎn)量顯著（P＜0.05）高于CK（9.23%），說明75%化肥＋菌肥處理對岷山紅三葉具有顯著增產(chǎn)效果；處理C與CK相比無顯著差異，說明該處理可以在不減產(chǎn)的同時，減少50%化肥的用量，從而有效降低生產(chǎn)成本；處理A、B與CK相比差異顯著（P＜0.05），產(chǎn)量顯著低于CK（第1茬）。各菌肥處理對岷山紅三葉干草產(chǎn)量的增產(chǎn)效果主要體現(xiàn)在第1茬，處理C、D與CK相比，第2茬干草產(chǎn)量沒有顯著差異，但處理C、D略高于CK，這可能是由于菌肥在植株生長后期促生效果相對減弱造成。紅三葉總干草產(chǎn)量也因不同菌肥處理而呈現(xiàn)出不同規(guī)律，其中處理D（75%化肥＋菌肥）效果最好，較CK高4.77%。

表3 不同施肥處理對岷山紅三葉干草產(chǎn)量的影響Table 3 Effect of different fertilizer application on dry yield of clover g/盆Pot

2.4 微生物菌肥對岷山紅三葉營養(yǎng)品質的影響

2.4.1 微生物菌肥對岷山紅三葉粗蛋白、粗灰分、中性洗滌纖維、酸性洗滌纖維的影響 不同菌肥處理后岷山紅三葉粗蛋白含量差異顯著（P＜0.05）（表4）。處理D（75%化肥＋菌肥）效果明顯優(yōu)于CK，第1、2茬粗蛋白含量分別比CK高11.25%和11.56%。處理C（50%化肥＋菌肥）與CK相比無顯著性差異，處理A和B使用效果均不及CK。各處理對兩茬岷山紅三葉中蛋白質含量變化影響較大，這可能與播種前為岷山紅三葉種子接種根瘤菌有關，其固氮效果明顯增加。

PGPR菌肥對兩茬岷山紅三葉粗灰分含量均有明顯影響（表4）。兩茬紅三葉中粗灰分含量在各處理間差異顯著（P＜0.05），岷山紅三葉中粗灰分含量由高到低依次為：處理D＞處理C（對照CK）＞處理B＞處理A。

各施肥處理對兩茬岷山紅三葉中性洗滌纖維含量影響顯著（P＜0.05）（表4），第1茬中處理D與CK之間差異顯著（P＜0.05），處理D較CK中性洗滌纖維含量顯著下降7.55%，處理C與CK之間差異不顯著，處理A的NDF含量最高。第2茬處理CK、處理C與處理D之間差異均不顯著，處理D的NDF含量最低。

兩茬岷山紅三葉酸性洗滌纖維含量因處理不同而存在明顯差異（表4）。各處理中，除兩茬處理D和第1茬處理C的ADF含量較CK有所降低之外，其余各處理ADF含量均高于CK，其中第1茬中處理C、處理D較CK分別降低4.50%和7.54%。第2茬處理C、處理D與CK之間差異不顯著，處理A的ADF含量最高。

表4 不同施肥處理下岷山紅三葉粗蛋白（CP）、粗灰分（CA）、中性洗滌纖維（NDF）、酸性洗滌纖維（ADF）含量比較Table 4 Effect of different fertilizer application on crude protein（CP），crude ash（CA），neutral detergent fiber（NDF）and acid detergent fiber（ADF）content of clover %

2.4.2 微生物菌肥對岷山紅三葉鈣、磷含量的影響 岷山紅三葉鈣含量因菌肥不同而差異顯著（P＜0.05）。除處理A外，其余處理紅三葉含量均是第1茬高于第2茬，菌肥處理替代75%（處理B）化肥較CK鈣含量顯著下降15.38%（第1茬）、28.16%（第2茬）。第1茬，處理C（50%化肥＋菌肥）與CK差異不顯著，處理D（75%化肥＋菌肥）顯著高于CK 13.33%（P＜0.05）。第2茬，處理C、D與CK鈣含量差異不顯著（圖1）。

復合菌肥不同處理對岷山紅三葉磷含量影響明顯，單施菌肥（處理A），岷山紅三葉磷含量在第1茬較CK顯著下降18.52%（P＜0.05），第2茬下降24.79%；菌肥替代75%化肥（處理B），兩茬植株磷含量均有所下降，但下降幅度不明顯。并且，第1茬的下降幅度低于第2茬。菌肥代替50%化肥（處理C），岷山紅三葉磷含量較CK顯著增加12.35%（第1茬）（P＜0.05），8.26%（第2茬），而處理D與C雖有差異，但不顯著（圖2）。

2.5 微生物菌肥對岷山紅三葉異黃酮含量的影響

從表5可以看出，與CK相比，處理C、D對岷山紅三葉中大豆黃素的含量無顯著影響；處理A、B（第1茬）和處理A（第2茬）使大豆黃素的含量較CK下降37.5%，12.5%，42.1%。岷山紅三葉中染料木黃酮的含量在兩茬之間的變化規(guī)律與大豆黃素大致相同，處理C、D與CK相比并無顯著性差異。此外，處理D顯著提高了兩茬紅三葉中刺芒柄花素的含量（P＜0.05）。作為4種異黃酮中含量最高的鷹嘴豆芽素，處理C、D與CK間無顯著性差異，處理A、B顯著降低，說明減少一半以上化肥用量會對植株的異黃銅含量產(chǎn)生較大影響，其含量明顯降低，而處理C可以在不降低異黃酮含量的情況下節(jié)省50%化肥的消耗。

圖1 不同施肥處理下岷山紅三葉鈣含量的比較Fig.1 Comparison to calcium content of clover under different fertilizer application

圖2 不同施肥處理下岷山紅三葉磷含量的比較Fig.2 Comparison to phosphorus content of clover under different fertilizer application

表5 不同施肥處理下紅三葉異黃酮含量比較Table 5 Effect of different fertilizer application on isoflavone content of clover %

3 討論

3.1 根際優(yōu)良促生菌（PGPR）對岷山紅三葉生長的影響

土壤中氮、磷缺乏，有效利用率低是制約農(nóng)作物增產(chǎn)增收的主要因素，微生物菌肥的研究利用為解決這一問題提供了有效途徑。接種具有較高固氮酶活性的根瘤菌可以通過其生物固氮途徑為作物提供環(huán)保的氮肥［18］，接種優(yōu)良溶磷菌可以轉化土壤中難以吸收利用的磷進而被植物吸收利用［19］。研究發(fā)現(xiàn)，將具有固氮、溶磷特性的PGPR菌肥應用于蘋果樹（Malusdomestica）［20］、草莓（Fragaria×ananassa）［21］、青稞（Hordeumvulgare）［22］、甘蔗（Saccharum）［23］取得了良好的效果。本研究也發(fā)現(xiàn)，將岷山紅三葉根際分離出的根際促生菌（MHS30溶磷量229.50mg/L）與根部分離的根瘤菌MHSG1（固氮酶活性488.20C2H4nmol/mL·h）結合使用可以使岷山紅三葉增產(chǎn)。此外，許多PGPR可通過自身代謝產(chǎn)生吲哚乙酸、脫落酸、細胞分裂素、赤霉素等植物激素，進而促進植物生長發(fā)育，調節(jié)植物的生命活動［8，24－25］。從表1可以看出，從岷山紅三葉根際分離的MHS19根際細菌分泌IAA能力較強（12.01μg/mL），IAA對岷山紅三葉根長以及根毛增生有良好的促進作用，這可能是岷山紅三葉在減量施用化肥之后還可以保持較高產(chǎn)量的重要原因之一。類似結論出現(xiàn)在其他研究中，Shahab等［26］發(fā)現(xiàn)，PGPR培養(yǎng)液中可以檢測到吲哚乙酸和吲哚丁酸，這兩類物質有助于促進綠豆根徑的生長。Wahyudi等［27］從印度尼西亞大豆（Glycinemax）根際分離得到的118株芽孢桿菌中，有76.3%具有促生能力，并且都會分泌吲哚乙酸。由此可見，PGPR產(chǎn)生的植物生長激素在植物促生過程中發(fā)揮著重要作用。PGPR的促生作用除了固氮、溶磷、分泌IAA外，還可以通過脂多糖、鐵載體和水楊酸等介導使植物對疾病和病原菌產(chǎn)生系統(tǒng)抗性，進而對細菌、真菌和病毒產(chǎn)生拮抗作用，以達到防治病害的目的［28］。從岷山紅三葉根際分離的菌株MHS27具有拮抗病原菌Rhizoctoniasolani、Fusariumoxysporumf.niveum的能力，將不同種類的PGPR菌株混合可能有助于產(chǎn)生更強的誘導系統(tǒng)抗性，從而提高岷山紅三葉的抗病能力［29］，因此，岷山紅三葉的增產(chǎn)效果離不開PGPR誘導系統(tǒng)抗性作用的發(fā)揮。這一促生機制已經(jīng)在番茄和辣椒（Capsicumannuum）的研究當中得到了證實［30］。除以上作用機制外，PGPR還可以通過以下途徑發(fā)揮促生作用，如：接種關鍵酶（如：ACC脫氨酶，幾丁質酶等），或產(chǎn)生胞外多糖、根瘤菌毒素等［31］。其中，根瘤菌毒素在ACC脫氨酶作用的上游切斷ACC合成路徑，通過減弱高乙烯濃度對作物的脅迫并提高作物結瘤進而促進作物根系生長。另外，PGPR自身產(chǎn)生ACC脫氨酶，裂解乙烯前體物質ACC，降低植物體內的乙烯濃度，抑制乙烯對植物的三重反應，提高養(yǎng)分吸收和陽光的捕獲面積，增加植物干物質積累，擴增根部組織，增強植物對根際微生物分泌或分解的促生物質和土壤養(yǎng)分的有效利用，進而促進生長［32］。

3.2 根際優(yōu)良促生菌（PGPR）對岷山紅三葉品質的影響

研究資料表明，微生物復合菌肥可以有效促進作物生長使其增產(chǎn)，降低生產(chǎn)成本，而且在改善作物營養(yǎng)品質方面也具有較大潛力。通過研究PGPR復合菌肥對岷山紅三葉的施用效果發(fā)現(xiàn)，75%化肥＋菌肥的處理使紅三葉中粗蛋白、粗灰分、鈣、磷及異黃酮的含量較CK都有所增加。出現(xiàn)這樣的結果與復合菌肥的溶磷作用及產(chǎn)生IAA有關，也可能是因為菌肥中的微生物協(xié)同作用的結果。菌肥中的有益微生物可分解釋放土壤中被固定的養(yǎng)分供作物吸收利用，如解磷微生物分泌出的有機酸可以降低土壤pH，提高P、Ca、Fe、Mn等礦物元素的有效利用率［33－35］。此外，植物體內主要礦質元素（P、Ca、Fe、Mn、Zn）的吸收利用與乙烯濃度有很大關聯(lián)，作物體內大量乙烯的產(chǎn)生會減少豆科作物根瘤的產(chǎn)生，影響其固氮效果，同時乙烯會抑制非豆科植物根的伸長，阻礙植物對土壤中的礦質元素的吸收和積累。Nadeem等［36］研究發(fā)現(xiàn)，降低乙烯濃度的關鍵是減少乙烯合成的前體ACC（1－氨基環(huán)丙烷－1－羧酸）的含量，PGPR產(chǎn)生的ACC脫氨酶將ACC脫氨基轉化為α－酮丁酸，降低植物體內乙烯的合成，從而促進作物生長。這一研究成果在后續(xù)研究中得到了驗證，研究發(fā)現(xiàn)在棉花（Gossypiumhirsutum）上接種包含ACC脫氨酶的菌株（Klebsiellaoxytoca）有助于提高主要營養(yǎng)元素（如：N、P、K、Ca）的吸收利用率，促使作物礦物元素的積累增加，促進作物根伸長、干重增加［37］。與單一接種劑相比，復合接種劑的使用對于提高作物營養(yǎng)品質具有明顯優(yōu)勢。類似的結論在PGPR復合菌肥應用于三葉草（Trifoliumrepens）［38］、山莓（Rubuscorchorifoliusf.）［39］的研究當中也得到了證實。此外，適宜比例的化學肥料與微生物菌肥相結合的施用方式有助于提高土壤微生物種群密度，可以改善土壤微生態(tài)環(huán)境，提高土壤速效氮、磷、鉀的含量，最終顯著提高植物的肥料利用率［40－41］。

綜上可知，植物促生菌的促生效果僅僅依靠某種單一的促生途徑是無法實現(xiàn)的，通常通過幾種機制共同來發(fā)揮促生作用，并且促生效果與寄主植物以及土壤特性的綜合作用都有關系。PGPR復合菌肥的使用為岷山紅三葉增產(chǎn)提供了有效途徑，將PGPR與化學肥料配合使用的生產(chǎn)方式可以減少對非再生能源的大量消耗，減輕對農(nóng)業(yè)生態(tài)環(huán)境的破壞，對于提高農(nóng)產(chǎn)品品質，食品安全性和可信度，保障農(nóng)牧業(yè)可持續(xù)發(fā)展具有積極意義。然而，促生菌肥的應用效果除了與施用區(qū)氣候特點、土壤狀況有關，還受到包括菌種來源、菌劑組成、施用量等因素的影響。因此，在本研究的基礎上進一步探索PGPR微生物菌肥對岷山紅三葉的促生機理及其對土壤特性的影響，并優(yōu)化各類影響因子，以期制備最佳的生物菌肥，選擇更適宜的化肥與菌肥配比，便于大面積推廣使用，為實現(xiàn)岷山紅三葉的環(huán)保型優(yōu)質高產(chǎn)提供技術支撐。

4 結論

本研究對甘肅岷縣地區(qū)獲得的植物根際促生菌進行篩選，獲得6株優(yōu)良根際促生菌及1株根瘤菌，按照一定的比例混合制作根際復合微生物菌肥，并將其應用于岷山紅三葉，盆栽試驗結果表明：75%化肥＋菌肥處理使岷山紅三葉干草總產(chǎn)量較CK增加4.76%，50%化肥＋菌肥處理在沒有顯著影響岷山紅三葉總干草產(chǎn)量的情況下可節(jié)省一半化肥。75%化肥＋菌肥的處理使紅三葉中粗蛋白、粗灰分、鈣、磷的含量較CK都有所增加，中性洗滌纖維、酸性洗滌纖維相對降低；50%化肥＋菌肥的處理雖然沒有顯著提高紅三葉的營養(yǎng)品質，但有助于減少化肥用量。通過測定各處理的岷山紅三葉異黃酮含量的結果表明采用微生物菌肥替代50%化肥的處理并沒有對4種異黃酮的含量造成顯著影響，但卻節(jié)省了50%化肥成本。

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