董海波，王紹慶，賈媛媛，端木永前，陶詩煜，倪迎冬，張?jiān)词纾f蘇，沈向真，趙茹茜

（南京農(nóng)業(yè)大學(xué) 農(nóng)業(yè)部動(dòng)物生理生化重點(diǎn)開放實(shí)驗(yàn)室，江蘇 南京210095）

亞急性瘤胃酸中毒的典型特征是攝食后瘤胃液pH在5.2～5.6之間并持續(xù)至少3h/d［1］。這種代謝紊亂的出現(xiàn)通常是由于動(dòng)物攝入過量的可快速發(fā)酵的碳水化合物，而瘤胃不能及時(shí)中和其發(fā)酵產(chǎn)生的有機(jī)酸所致［2－4］。Fairfield等［5］研究表明約20%的商業(yè)化奶牛牧場(chǎng)中泌乳早期及中期奶牛瘤胃pH＜5.5，出現(xiàn)亞急性瘤胃酸中毒（SARA）狀態(tài)，導(dǎo)致牧場(chǎng)每頭牛每天損失約1.12美元，因此SARA已經(jīng)成為乳業(yè)的主要關(guān)注問題之一。增加奶牛能量攝食是緩解奶牛熱應(yīng)激的重要措施，提高精料喂量，可在一定程度上增加能量攝入，提高養(yǎng)分消化率，改變氨基酸的代謝流向，緩解能量負(fù)平衡，但易引起奶牛代謝熱增加和瘤胃酸中毒［2，6］。然而，在生產(chǎn)中由于亞急性瘤胃酸中毒的診斷復(fù)雜性故不易被準(zhǔn)確診斷出，目前主要以瘤胃液的pH變化作為主要的診斷依據(jù)［7－8］。嘗試一些其他組織的探索（如血液的代謝參數(shù)變化）從中找出相應(yīng)的關(guān)鍵指標(biāo)指示亞急性瘤胃酸中毒狀態(tài)也越來越被重視［9－10］。

有研究報(bào)道亞急性瘤胃酸中毒會(huì)導(dǎo)致乳產(chǎn)量下降，脂代謝和蛋白代謝發(fā)生變化特別是乳脂與乳蛋白含量的變化［4，11－12］。然而，目前有關(guān)SARA狀態(tài)時(shí)糖代謝的研究報(bào)道較少。動(dòng)物機(jī)體負(fù)責(zé)能量代謝的主要器官和組織包括肝臟，肌肉以及脂肪組織。葡萄糖是動(dòng)物機(jī)體重要的能源物質(zhì)和代謝底物，主要通過食物攝取以及組織合成，如肝臟，肌肉等。肝臟是調(diào)節(jié)機(jī)體能量平衡尤其是糖、脂代謝的主要器官，對(duì)營(yíng)養(yǎng)分配起著重要作用［13］，反芻動(dòng)物肝臟是糖異生的主要場(chǎng)所［14］。肝臟中葡萄糖的轉(zhuǎn)運(yùn)與葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白2（Glut2）的表達(dá)呈正相關(guān)，但Glut2的表達(dá)與各種激素的控制也密不可分［15］。肌肉是維持機(jī)體機(jī)動(dòng)性與代謝健康的基本組織，其代謝穩(wěn)態(tài)在機(jī)體遭遇代謝應(yīng)激時(shí)（包括飲食與鍛煉）會(huì)通過調(diào)控肌肉線粒體數(shù)量與功能以及葡萄糖代謝的變化以適應(yīng)不同的應(yīng)激［16］。肌肉中葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白4（Glut4）作為胰島素敏感性葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)載體可以減少外周血葡萄糖水平的上升［17］。有研究報(bào)道不同的動(dòng)物或者人類肥胖模型均展現(xiàn)出脂肪組織中Glut4的表達(dá)下降，而不是肌肉［18］。此外，脂肪作為能量?jī)?chǔ)備的重要組織，在機(jī)體能量代謝不足時(shí)被分解供能，對(duì)機(jī)體的能量平衡起著重要作用，脂肪能值高，可以啟動(dòng)能量代謝調(diào)節(jié)系統(tǒng)，有利于奶牛能量平衡［19］。本研究旨在模擬實(shí)際生產(chǎn)中的飼喂模式，通過長(zhǎng)期飼喂高精料日糧，初步探索其對(duì)泌乳期反芻動(dòng)物能量代謝的血液生化參數(shù)和相關(guān)基因表達(dá)的影響。

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器

TRIzol?Reagent購自上海英俊生物技術(shù)有限公司；SYBR?Premix Ex TaqTM購自Takara公司；冷凍離心機(jī)（AllegraTM64R，BECKMAN COULTERTM，USA）；組織勻漿器；PCR儀（STRATAGENE，USA）；酶標(biāo)儀（Synergy2，Biotek，USA）；NanoDrop TM1000sepctrophotometer（Thermo Scientific，USA）。

1.2 試驗(yàn)動(dòng)物與飼養(yǎng)

本實(shí)驗(yàn)于2013年6月2日開始選用健康狀況良好，體重（47±8）kg的泌乳期山羊8只，手術(shù)安裝永久性瘤胃瘺管，恢復(fù)期為14d，隨機(jī)分成2組（4只/組）飼養(yǎng)于南京農(nóng)業(yè)大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物房，單籠飼養(yǎng)，分別飼喂精粗比為40∶60和60∶40的日糧，自由飲水，每日飼喂時(shí)間為早08：00和晚18：00。

1.3 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

本試驗(yàn)隨機(jī)分為2組，分別飼喂精粗比40∶60（LC）和60∶40（HC）日糧（由羊草、苜蓿草和精料組成），粗料由20%苜蓿草和80%羊草組成。2組日糧總能量和總蛋白含量相等。試驗(yàn)期包括適應(yīng)期2周和采樣期6周。飼料營(yíng)養(yǎng)成分同以往研究報(bào)道［20］。

1.4 樣品采集處理與分析測(cè)定

1.4.1 瘤胃液采集和處理 實(shí)驗(yàn)結(jié)束后分別于采食前0h，以及采食后1，2，3和5h通過瘤胃瘺管采集瘤胃液10mL（經(jīng)孔徑為0.15mm尼龍絹過濾），測(cè)定pH值。

1.4.2 肝臟，肌肉，脂肪的采集、RNA的提取及Real－time PCR 實(shí)驗(yàn)結(jié)束將山羊宰殺后采集肝臟，肌肉，脂肪并迅速置于液氮中保存，待提取RNA。采用TRIzol一步法提取樣品總RNA，NanoDropTM1000分光光度法測(cè)定總RNA的濃度和純度，2%瓊脂糖凝膠電泳驗(yàn)證RNA質(zhì)量，－70℃保存?zhèn)溆?。反轉(zhuǎn)錄酶體系及Tap酶為Promega產(chǎn)品，SYBR?購自TaKaRa公司。引物采用Primer 5.0軟件自行設(shè)計(jì)，由上海捷瑞生物工程有限公司合成，引物列表見表1。

實(shí)時(shí)熒光定量分析采用2－ΔΔCT法，以內(nèi)標(biāo)基因β－actin為參照，計(jì)算目的基因轉(zhuǎn)錄的相對(duì)量，通過以下公式計(jì)算出每一個(gè)樣本的ΔΔCT值，最后每一個(gè)樣本值以2－ΔΔCT表示。X表示任意一個(gè)樣本，公式如下：

1.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

采用SPSS 17.0軟件進(jìn)行單變量雙因素分析，主效應(yīng)分別為日糧處理和采樣時(shí)間；用ANOVA進(jìn)行方差分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同精粗比日糧對(duì)瘤胃液pH的影響

雙因素（日糧效應(yīng)與時(shí)間效應(yīng)）分析結(jié)果顯示（圖1），日糧和采食后發(fā)酵時(shí)間顯著影響瘤胃液pH（P＜0.05）。高精料飼喂2周后，攝食后山羊瘤胃液pH低至5.2～5.8，持續(xù)時(shí)間超過3h（圖1A），符合瘤胃亞急性酸中毒的狀態(tài)，而LC組山羊瘤胃液pH處于正常變動(dòng)范圍。然而，高精料飼喂8周后，瘤胃液pH升高，采食后瘤胃pH均高于6.0，但仍低于LC組山羊（圖1B）。

2.2 不同精粗比日糧對(duì)血液生化指標(biāo)的影響

由表2顯示，與LC組相比較，HC組山羊血漿中谷草轉(zhuǎn)氨酶濃度有上升的趨勢(shì)（P＝0.09），血糖含量顯著升高（P＜0.05），血液中游離脂肪酸（NEFA）濃度有上升的趨勢(shì)（P＝0.071）（圖2），但血液中甘油三酯和膽固醇的含量無顯著變化。

表1 目的基因序列Table 1 The primer sequences of the target genes

圖1 不同精粗比日糧對(duì)瘤胃液pH的影響Fig.1 Effect of different concentrate ratio diets on rumen pH

2.3 糖代謝相關(guān)基因mRNA表達(dá)變化

如圖3所示，與LC組相比，HC組山羊肝臟中葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白Glut4mRNA表達(dá)有升高的趨勢(shì)（P＝0.06，圖3），肌肉中PCK2mRNA表達(dá)和脂肪組織中PC mRNA表達(dá)呈上升趨勢(shì)（P＝0.066，P＝0.069），其他糖代謝相關(guān)基因的表達(dá)未見顯著性變化（P＞0.05）。

表2 血液生化指標(biāo)Table 2 The plasma biochemical index

圖2 不同精粗比日糧對(duì)血漿中非飽和脂肪酸（NEFA）的影響Fig.2 The effect of different concentrate ratio on NEFA of plasma

如圖4所示，在LC組中不同組織間Glut4，PC和PCK2基因的表達(dá)有差異。肝臟和肌肉組織相比，肌肉中Glut4mRNA表達(dá)豐度最高，達(dá)極顯著水平（P＜0.01）；而肝臟中PC和PCK2mRNA表達(dá)豐度極顯著高于肌肉和脂肪組織（P＜0.01），脂肪組織中PCK2表達(dá)量顯著高于肌肉組織（P＜0.05）。

3 討論

3.1 不同精粗比對(duì)瘤胃液pH及血液生化指標(biāo)的影響

為了滿足泌乳的能量需求和提高泌乳性能，通常給泌乳反芻動(dòng)物飼喂富含能量的高精料日糧；然而攝入過多的可快速發(fā)酵的碳水化合物易導(dǎo)致瘤胃中揮發(fā)性脂肪酸的沉積，以及異常代謝產(chǎn)物如脂多糖（LPS）和組胺的累積，從而導(dǎo)致泌乳早期和中期瘤胃亞急性瘤胃酸中毒［2，21－23］。本研究發(fā)現(xiàn)，給泌乳中期奶山羊飼喂60%精料日糧2周后，瘤胃液pH＜5.8并持續(xù)3h/d以上符合亞急性瘤胃酸中毒的界定范圍，與以往的研究結(jié)果相吻合［21，24］。然而，高精料飼喂8周后山羊采食后瘤胃液pH升高至6.0以上，但仍低于LC組山羊。以上結(jié)果提示瘤胃組織對(duì)長(zhǎng)期飼喂高精料日糧出現(xiàn)適應(yīng)現(xiàn)象［25］。此外，有文獻(xiàn)報(bào)道苜蓿（Medicagosativa）是高果膠（5%～10%）飼料，且富含鈣、鉀等堿性元素，具有較強(qiáng)的緩沖能力，果膠雖在瘤胃中降解快，但發(fā)酵產(chǎn)物是半乳糖醛酸，抑制了酸性乳酸菌的發(fā)酵，從而有助于瘤胃液pH值的穩(wěn)定［26］。

谷丙轉(zhuǎn)氨酶（ALT）和谷草轉(zhuǎn)氨酶（AST）是動(dòng)物體內(nèi)最為重要的2種轉(zhuǎn)氨酶，主要分布在肝臟、骨骼肌、腎臟、心肌等組織中，正常血清中含量低，但當(dāng)上述組織細(xì)胞受損時(shí)，會(huì)導(dǎo)致酶活性升高［27］。本研究通過檢測(cè)血液生化指標(biāo)發(fā)現(xiàn)，與LC組相比HC組山羊血液ALT無顯著變化，但是AST有上升的趨勢(shì)。這可能與機(jī)體為適應(yīng)泌乳等生理需要，通過自身調(diào)節(jié)增強(qiáng)機(jī)體組織（如脂肪動(dòng)員、蛋白動(dòng)員等）代謝，導(dǎo)致AST活性增加有關(guān)［28］。此外，血液AST的增加也可能提示HC組山羊組織器官的損傷，如氧化應(yīng)激損傷［29］。與LC組相比，HC組山羊血漿中NEFA有升高的趨勢(shì)，血漿葡萄糖的含量顯著升高。研究證明，血漿中NEFA的含量常被用于衡量機(jī)體能量狀態(tài)，NEFA升高提示動(dòng)物機(jī)體能量暫時(shí)供應(yīng)不足［30］，這可能是與長(zhǎng)期飼喂高精料日糧導(dǎo)致食欲抑制有關(guān)［31］。當(dāng)能量攝入不足時(shí)，為了改善營(yíng)養(yǎng)缺乏，奶牛會(huì)動(dòng)用體內(nèi)儲(chǔ)備的脂肪和蛋白質(zhì)滿足泌乳需要，如奶牛動(dòng)用體脂滿足能量需要，動(dòng)用體蛋白質(zhì)分解為氨基酸去滿足肝糖異生［32］。葡萄糖作為乳糖合成的底物被乳腺攝取最終決定著奶產(chǎn)量的多少，而葡萄糖的主要來源則是肝臟糖異生。有研究報(bào)道，飼喂高精料日糧后引起反芻動(dòng)物肝臟糖異生加強(qiáng)并伴隨血液中葡萄糖含量顯著上升［9－10］，與本研究結(jié)果相吻合。

圖3 不同精粗比日糧對(duì)不同組織中糖代謝相關(guān)基因mRNA表達(dá)的影響Fig.3 The effect of different concentrate diet on mRNA expression of glucose metabolic genes in different tissues

圖4 LC組中不同組織間糖代謝相關(guān)基因mRNA表達(dá)變化Fig.4 The effect of low concentrate diet on mRNA expression of glucose metabolic genes between different tissues in LC group

3.2 不同精粗比日糧對(duì)不同組織糖代謝相關(guān)基因表達(dá)的影響

肝臟對(duì)機(jī)體能量平衡起到重要作用，是糖酵解、糖原合成以及脂肪生成的重要位點(diǎn)［32］。特別是反芻動(dòng)物，肝臟是提供乳糖合成所需葡萄糖來源的主要場(chǎng)所，占糖異生的80%［14，33］。本研究發(fā)現(xiàn)，長(zhǎng)期飼喂高精料日糧后HC組肝臟中與糖分解或合成代謝相關(guān)的基因均未發(fā)生顯著變化，與葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)相關(guān)的蛋白Glut2基因表達(dá)也未發(fā)生變化，但胰島素敏感性葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白Glut4mRNA表達(dá)有上調(diào)趨勢(shì)。以往研究報(bào)道，葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白Glut家族中，Glut2主要分布在肝臟、腎以及胰腺β細(xì)胞；Glut4則主要分布在肌肉與脂肪組織中［34］，關(guān)于反芻動(dòng)物肝臟中表達(dá)Glut4的報(bào)道甚少。本研究發(fā)現(xiàn)Glut4在肝臟中表達(dá)并有上升趨勢(shì)，說明Glut4也可能參與到肝臟糖異生及外周血液葡萄糖代謝變化。有研究指出肌肉中葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白4（Glut4）作為胰島素敏感性葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)載體可以減少外周血葡萄糖水平的上升，但肝臟中Glut4表達(dá)上升是否與血糖上升有關(guān)還不清楚，血糖的升高可能是機(jī)體能量代謝變化的綜合結(jié)果。此外，通過組織間比較發(fā)現(xiàn)，肌肉中Glut4mRNA表達(dá)最高，其表達(dá)豐度是肝臟的54倍，這與以往的研究報(bào)道相一致［15］。

泌乳期尤其是泌乳早期的反芻動(dòng)物，通常處于能量負(fù)平衡狀態(tài)，血液胰島素含量升高并出現(xiàn)肌肉與脂肪組織胰島素抵抗現(xiàn)象［14］。有研究報(bào)道，高水平胰島素有抑制糖異生的作用［34］。本研究發(fā)現(xiàn)，肌肉與脂肪中糖代謝的關(guān)鍵酶PCK2和PC的表達(dá)量均有上升的趨勢(shì)。PEPCK是糖異生的限速酶，有2個(gè)亞型即PCK1和PCK2分別位于胞漿和線粒體內(nèi)［35］，PCK1較適合于以氨基酸為底物的糖異生，而PCK2則較適合于以乳酸為底物的糖異生［36］。本研究發(fā)現(xiàn)肌肉中PCK2基因表達(dá)有上升趨勢(shì)，提示以乳酸為底物的糖異生加強(qiáng)。肌肉乳酸的升高也可能會(huì)為肝臟提供更多糖異生所需的碳源［14］。PC是糖異生的另一個(gè)關(guān)鍵酶，與PEPCK一起直接控制代謝產(chǎn)物。泌乳期奶牛為了增加泌乳量需要通過增強(qiáng)PC的表達(dá)提高內(nèi)源性葡萄糖的產(chǎn)生［14］。本研究結(jié)果提示，HC組山羊脂肪組織中PC基因表達(dá)上升可能是血糖升高的原因之一。此外，本研究發(fā)現(xiàn)，肝臟PC及PCK2mRNA表達(dá)均顯著高于肌肉和脂肪組織，這可能與反芻動(dòng)物肝臟的特殊功能有關(guān)。反芻動(dòng)物肝臟是利用來自瘤胃液丙酸異生成葡萄糖的主要場(chǎng)所［14］。

4 結(jié)論

長(zhǎng)期飼喂高精料日糧導(dǎo)致泌乳期山羊血液NEFA，AST和葡萄糖含量升高，以及肝臟、肌肉和脂肪組織中參與糖異生關(guān)鍵基因的表達(dá)上調(diào)，提示機(jī)體代謝紊亂及糖異生增強(qiáng)。

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