曹波　張琳琳　柴春香等

[摘要] 目的 探討烏司他丁對盲腸結扎穿孔術（CLP）所致大鼠膿毒癥急性腎損傷腎臟病理及尿相關指標的影響。 方法 SD健康雄性大鼠55只，按隨機化原則分成3組：正常對照組5只、模型組25只、烏司他丁治療組25只，后兩組再隨機分為5個時間點（1、6、12、24、48 h），每組每時間點各5只，采用CLP復制膿毒癥模型，烏司他丁治療組造模后立即給予烏司他丁100 000 U/kg，尾靜脈注射，分別在各個時間點采血、留尿標本，處死大鼠摘取腎臟，進行腎功能血肌酐（SCr）、尿素氮（BUN），尿腎損傷分子（KIM-1）、白細胞介素-18（IL-18）和中性粒細胞明膠酶相關脂質運載蛋白（NGAL）檢測分析，光鏡下觀察腎臟病理變化。 結果 模型組SCr、BUN的濃度CLP術后6 h開始升高，24 h達高峰，48 h開始下降，均顯著高于對照組（P<0.05），烏司他丁治療組12、24、48 h均顯著低于相應時間點模型組（P<0.05）。模型組尿KIM-1、NGAL、IL-18含量于CLP術后1 h開始升高，12 h達高峰，24 h開始下降，均顯著高于對照組，烏司他丁治療組6、12、24、48 h均顯著低于相應時間點模型組（P<0.05）。腎臟病理改變明顯好于模型組。 結論 烏司他丁對膿毒癥所致急性腎損傷具有腎臟保護作用。

[關鍵詞] 烏司他??；膿毒癥；急性腎損傷；腎臟病理

[中圖分類號] R692 [文獻標識碼] A [文章編號] 1674-4721（2014）02（c）-0011-04

膿毒癥并發(fā)急性腎損傷的發(fā)病率為19%～23%，當膿毒癥并發(fā)急性腎損傷時，不僅給有效干預手段帶來困難，增加患者死亡率，而且耗費巨大的醫(yī)療資源和巨額醫(yī)療費用，因此，及早防治膿毒癥并發(fā)急性腎損傷，保護腎功能意義重大[1]。烏司他丁是從尿中分離純化出來的一種糖蛋白，具有穩(wěn)定細胞膜及細胞亞膜、穩(wěn)定溶酶體膜抑制溶酶體釋放、清除自由基、抑制炎癥介質釋放、改善微循環(huán)衰竭狀態(tài)、抑制蛋白質分解代謝亢進等作用，并對多臟器損傷有保護作用[2-4]。本研究通過盲腸結扎穿孔術[5]（cecal ligation and puncture，CLP）建立膿毒癥大鼠急性腎損傷模型，觀察烏司他丁對膿毒癥所致急性腎損傷的腎臟病理及尿指標變化，探討烏司他丁對腎臟的保護作用及其機制，為臨床應用提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料和儀器

烏司他?。◤V東天普生物化學制藥公司）；腎損傷分子1（KIM-1）、ELISA試劑盒（美國R&D公司），白細胞介素18（IL-18）、ELISA試劑盒（武漢博士德公司），中性粒細胞明膠酶相關脂質運載蛋白（NGAL）、ELISA試劑盒（上海藍基生物有限公司）。

1.2 實驗動物和分組

SD健康雄性大鼠55只，體質量200～250 g，適應性喂養(yǎng)1周，實驗大鼠按隨機化原則分成3組。①正常對照組（n=5）：尾靜脈推注生理鹽水2 ml；②模型組（n=25）：行CLP；③烏司他丁治療組（n=25）：行CLP后即刻尾靜脈注射烏司他丁100 000 U/kg。模型組、烏司他丁治療組，再隨機分為5個時間點（1、6、12、24、48 h），每組每時間點各5只，術后均補充生理鹽水3 ml/100 g抗休克。

1.3 動物模型制備

實驗前禁食12 h，手術組采用經典的CLP復制膿毒癥急性腎損傷模型，即用10%水合氯醛0.3 ml/100 g腹腔麻醉，無菌條件下沿腹中線切開長約2 cm，分離、結扎盲腸，在盲端腸壁用12號針穿刺2次，留置1條長1 cm寬2 mm、兩頭貫穿盲腸的橡皮片，擠出少許糞便，將盲腸還納腹腔，逐層縫合腹壁，編號，清醒后轉入代謝籠內自由進水、進食。術畢補充生理鹽水3 ml/100 g，術后自由飲食（水）。

1.4 留取標本

從術后腹壁縫合結束開始計時，分別于1、6、12、24、48 h取材，下腔靜脈抽血5 ml，離心（3000 r/min）15 min，取血清于-20℃保存，待測血肌酐（SCr）、尿素氮（BUN）；膀胱分離，膀胱穿刺收集尿標本于-20℃保存，待測KIM-1、IL-18、NGAL；后放血處死大鼠，取左腎切開置于10%多聚甲醛中固定，石蠟包埋，HE染色，光鏡下×200下取3個視野觀察腎臟病理變化。

1.5 指標檢測

采用生化分析儀測定SCr、BUN。尿液標本均采用ELISA法檢測KIM-1、IL-18和NGAL。

1.6 統(tǒng)計學處理

采用SPSS 17.0對數據進行分析，計量資料用均數±標準差（x±s）表示，應用獨立樣本t檢驗，兩兩比較用SNK-q檢驗，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 大鼠腎臟的病理改變

HE染色光鏡下，正常對照組腎小球、腎小管結構正常；模型組12 h開始出現炎性損傷，以24 h最為顯著，表現為腎組織彌漫性單核-巨噬細胞浸潤，組織間隙水腫明顯，腎小管上皮細胞空泡變性、腫脹、脫落，甚至出現裸膜，部分腎小管腔閉塞，腎小管腔代償擴張，管型形成；烏司他丁治療組也存在單核-巨噬細胞浸潤，組織間隙水腫，腎小管上皮細胞空泡變性、腫脹、脫落，部分腎小管腔閉塞，腎小管腔代償擴張，管型形成，明顯輕于相應時間點模型組。

2.2 大鼠腎功能的變化

CLP術后6 h，兩組大鼠SCr、BUN的濃度開始升高，24 h達高峰，48 h開始下降，均顯著高于對照組（P<0.05）。烏司他丁治療組12、24、48 h較模型組相應時間點SCr、BUN均顯著低，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）；烏司他丁治療組大鼠48 h時SCr、BUN的濃度明顯回落，但仍然高于對照組（P<0.05）（表1、表2）。

2.3 兩組大鼠尿KIM-1、NGAL、IL-18含量的變化

CLP術后兩組大鼠尿KIM-1、NGAL、IL-18均于1 h開始明顯升高，12 h達高峰，24、48 h下降，均顯著高于對照組（P<0.05）。烏司他丁治療組6、12、24、48 h較模型組相應時間點尿KIM-1、NGAL、IL-18含量顯著低，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）；烏司他丁治療組大鼠48 h時尿KIM-1、NGAL、IL-18含量回落顯著，但仍高于對照組（P<0.05）（表3～表5）。

3 討論

臨床實踐中，膿毒癥一旦并發(fā)腎臟損害，治療難度明顯增加，而且耗費巨大的醫(yī)療資源和巨額醫(yī)療費用。因此，及早防治膿毒癥并發(fā)急性腎損傷，保護腎功能意義重大[8-9]。膿毒癥致急性腎損傷的機制許多學者[1，4-6]認為可能是感染時所釋放的毒素以及活化的炎性細胞和炎癥介質釋放，激活Toll樣受體4，經過一系列級聯(lián)信號傳遞，相互促進，形成炎癥瀑布，從而啟動后續(xù)的一系列病理生理改變，導致急性腎損傷。KIM-1是一種新的Ⅰ型跨膜蛋白，參與腎小管上皮組織形態(tài)和功能的恢復，在急性腎損傷后呈現高水平表達，并可在尿中檢測出，在急性腎損傷大鼠模型的報道顯示其升高明顯早于其他傳統(tǒng)檢測指標的改變，可以作為急性損傷早期的檢測指標和治療效果評定指標[8-10]。NGAL是一種分泌性蛋白，研究表明，NGAL在正常腎組織中呈低水平表達，但在腎缺血/再灌注損傷和順鉑誘導小鼠腎損傷模型中，損傷后3 h時的尿液中即可檢測到NGAL，明顯早于尿NAG、β2微球蛋白及SCr的改變，是急性腎損傷的獨立預測因子，也是目前基礎實驗中經常選用的評價急性腎損傷的指標[8，10]。IL-18被認為與膿毒癥時臟器功能受損關系密切，IL-18能促進細胞凋亡，導致免疫功能紊亂，促進臟器功能損傷。曾有研究顯示，在小鼠腎缺血性損傷模型中，IL-18在Caspase-1作用下被激活，激活后IL-18可裂解為成熟形式釋放入尿，并可在尿中被檢測出，是目前經常選用的評價機體炎性反應程度和治療效果的指標[2，10]。有研究[10]證實KIM-1、NGAL、IL-18聯(lián)合檢測在評價膿毒癥致急性腎損傷程度及治療效果方面有更高的價值。本研究中采用經典的CLP復制急性腎損傷模型，應用腎臟病理變化，評價腎功能傳統(tǒng)指標SCr、BUN，及新型腎損傷標志物KIM-1、NGAL及反映炎性反應程度和治療效果的IL-18來反映膿毒癥大鼠急性腎損傷的變化。實驗大鼠結果顯示，腎臟病理：模型組12 h開始出現炎性損傷，以24 h最為顯著，表現為腎組織彌漫性單核-巨噬細胞浸潤，組織間隙水腫明顯，腎小管上皮細胞空泡變性、腫脹、脫落，甚至出現裸膜，部分腎小管腔閉塞，代償擴張，管型形成；CLP術后6 h，兩組大鼠SCr、BUN的濃度開始升高，24 h達高峰，48 h開始下降，尿KIM-1、NGAL、IL-18均于1 h開始明顯升高，12 h達高峰，24、48 h下降，均顯著高于對照組。

烏司他丁是從尿中分離純化出來的一種糖蛋白，主要通過靜脈方式給藥，給藥后在腎與肝迅速積累，5 min達到峰值，其生物利用度為100%，半衰期為40 min，主要通過腎臟代謝，具有抑制多種水解酶的活性，減輕水解酶對組織器官的損害，穩(wěn)定溶酶體膜、清除氧自由基及脂多糖、調控炎性介質釋放，抑制血栓素、血管內皮素的升高，維持內源性血管活性物質的動態(tài)平衡，抑制凝血系統(tǒng)活化，改善重要臟器灌流，改善循環(huán)障礙，起到多臟器的保護作用[11]。炎性細胞因子及介質的釋放在膿毒癥造成腎損傷中起了關鍵的作用[4-6]；Aosasa等[12]揭示烏司他丁通過抑制單核細胞內蛋白激酶C及核因子-κB（NF-κB）信號轉導通路來直接抑制TNF-α的翻譯和分泌；Inoue等[13]在小鼠腹腔注射脂多糖成功制造膿毒癥模型后給予烏司他丁干預能夠降低致炎因子的生成；余劍波等[14]報道顯示感染性休克炎性細胞因子TNF-α、IL-6和IL-8生成和釋放因烏司他丁的應用得到抑制；陸艷娟等[15]在脂多糖致大鼠多器官功能衰竭抗氧自由基的實驗中證實烏司他丁能夠糾正超氧化物歧化酶和丙二醛的惡性變化，對大鼠肝、腎組織有一定的保護作用；Nakatani等[16]在體外實驗中發(fā)現，烏司他丁不僅抑制細胞外中性粒細胞彈性蛋白酶活性，還抑制其在細胞內的活性和分泌，從而抑制中性粒細胞介導的內皮細胞損傷；以上研究均從不同角度驗證了烏司他丁在多臟器損傷中抑制炎癥反應程度、抗氧自由基和治療效果方面的優(yōu)勢，起到臟器保護作用。本研究結果發(fā)現，烏司他丁治療組腎臟病理變化：光鏡下存在單核-巨噬細胞浸潤，組織間隙水腫，腎小管上皮細胞空泡變性、腫脹、脫落，部分腎小管腔閉塞，代償擴張，管型形成，明顯輕于相應時間點模型組；造模后在12、24、48 h較模型組同時間點SCr、BUN均顯著低，于48 h時開始回落，但仍然高于對照組；尿KIM-1、NGAL、IL-18含量在造模后6、12、24、48 h較模型組相應時間點均顯著低，差異有統(tǒng)計學意義，于48 h時含量回落顯著，同樣高于對照組。從烏司他丁治療組病理變化、腎功能變化、反映腎損傷程度和炎癥反應狀態(tài)的指標變化分析，均起到了很好的腎臟保護作用，其機制可能與抑制炎癥因子及介質的釋放有關。

本研究通過CLP復制膿毒癥急性腎損傷模型，經烏司他丁治療，不論是腎功能指標，還是新型尿生物學指標的變化，腎臟病理的改善，均顯示了很好的腎臟保護作用，推測可能通過抑制炎癥介質釋放、改善微循環(huán)衰竭狀態(tài)等機制，達到對膿毒癥急性腎損傷大鼠腎臟的保護作用。

[參考文獻]

[1] Yohannes S，Chawla LS.Evolving practices in the management of acute kidney injury in the ICU[J].Clin Nephrol，2009，71（16）：602-607.

[2] 劉嬌，陳德昌，周青山.烏司他丁對膿毒癥急性腎損傷大鼠腎臟NOD1受體和血IL-18水平的影響[J].臨床外科雜志，2013，21（9）：691-693.

[3] 王虹，劉貴建，劉錦麗，等.烏司他丁對老年多器官功能障礙綜合征器官功能的保護作用[J].中國實用內科學雜志，2007，27（5）：242-244.

[4] Nesek-Adam V，Rasic Z，Kos J，et al.Puninotransferases after experimental pneumoperitoneum in dogs[J].Acta Anaesthesiol Scand，2004，48（7）：862-866.

[5] 桑珍珍，許云，盛英杰，等.重組人紅細胞生成素對膿毒癥大鼠腎臟的保護作用[J].中華腎臟病雜志，2012，28（12）：961-964.

[6] 孟建忠，郭愛華，李丹丹，等.鹽酸法舒地爾防治膿毒癥大鼠急性腎損傷的實驗研究[J].生物醫(yī)學工程研究，2010， 29（3）：197-201.

[7] 任延波.膿毒血癥時腎臟炎癥因子的變化：以大鼠為實驗動物的臨床研究[J].中國急救復蘇與災害醫(yī)學雜志，2008，3（10）：608-710.

[8] 李錦艷，劉虹，辛小梅.內毒素致大鼠急性腎損傷早期NGAL和KIM-1變化[J].中國醫(yī)療前沿，2011，6（9）：18-20.

[9] 王蓓蕾，張瑞，劉妍，等.化學藥物誘導的大鼠急性腎損傷模型中腎損傷分子-1表達的研究[J].天津醫(yī)藥，2012， 40（2）：138-140.

[10] 周芳芳，羅群，蘭凱.KIM-1、NGAL和IL-18聯(lián)合檢測在大鼠缺血再灌注急性腎損傷早期診斷中的意義[J].浙江醫(yī)學，2010，32（8）：1202-1204.

[11] 覃建明.烏司他丁的藥理作用及臨床應用進展[J].中國醫(yī)藥導報，2008，5（11）：19-20.

[12] Aosasa S，Ono S，Mochizuki H，et al.Mechanism of the inhibitory effect of protease inhibitor on tumor necrosis factor alpha production of monocytes[J].Shock，2001，15（2）：101-105.

[13] Inoue K，Takano H，Shimada A，et al.Urinary trypsin inhibitor protects against systemic inflammation induced by lipopolysacharide[J].Mol Pharmacol，2005，67（3）：673-680.

[14] 余劍波，姚尚龍，袁世熒.烏司他丁對感染性體克患者影響的臨床研究[J].中國急救醫(yī)學，2004，24（2）：135-136.

[15] 陸艷娟，王健春，李曉林，等.烏司他丁對多器官功能衰竭大鼠肝、腎組織氧自由基水平的影響[J].中國老年學雜志，2005，25（10）：1219-1221.

[16] Nakatani K，Takea S，Tsujimoto H，et al.Inhibitory effect of serine protease inhibitors on neutrophil-mediated endothelial cell injury[J].J Leukoc Biol，2001，69（2）：241-247.

（收稿日期：2013-12-27 本文編輯：郭靜娟）

[2] 劉嬌，陳德昌，周青山.烏司他丁對膿毒癥急性腎損傷大鼠腎臟NOD1受體和血IL-18水平的影響[J].臨床外科雜志，2013，21（9）：691-693.

[3] 王虹，劉貴建，劉錦麗，等.烏司他丁對老年多器官功能障礙綜合征器官功能的保護作用[J].中國實用內科學雜志，2007，27（5）：242-244.

[4] Nesek-Adam V，Rasic Z，Kos J，et al.Puninotransferases after experimental pneumoperitoneum in dogs[J].Acta Anaesthesiol Scand，2004，48（7）：862-866.

[5] 桑珍珍，許云，盛英杰，等.重組人紅細胞生成素對膿毒癥大鼠腎臟的保護作用[J].中華腎臟病雜志，2012，28（12）：961-964.

[6] 孟建忠，郭愛華，李丹丹，等.鹽酸法舒地爾防治膿毒癥大鼠急性腎損傷的實驗研究[J].生物醫(yī)學工程研究，2010， 29（3）：197-201.

[7] 任延波.膿毒血癥時腎臟炎癥因子的變化：以大鼠為實驗動物的臨床研究[J].中國急救復蘇與災害醫(yī)學雜志，2008，3（10）：608-710.

[8] 李錦艷，劉虹，辛小梅.內毒素致大鼠急性腎損傷早期NGAL和KIM-1變化[J].中國醫(yī)療前沿，2011，6（9）：18-20.

[9] 王蓓蕾，張瑞，劉妍，等.化學藥物誘導的大鼠急性腎損傷模型中腎損傷分子-1表達的研究[J].天津醫(yī)藥，2012， 40（2）：138-140.

[10] 周芳芳，羅群，蘭凱.KIM-1、NGAL和IL-18聯(lián)合檢測在大鼠缺血再灌注急性腎損傷早期診斷中的意義[J].浙江醫(yī)學，2010，32（8）：1202-1204.

[11] 覃建明.烏司他丁的藥理作用及臨床應用進展[J].中國醫(yī)藥導報，2008，5（11）：19-20.

[12] Aosasa S，Ono S，Mochizuki H，et al.Mechanism of the inhibitory effect of protease inhibitor on tumor necrosis factor alpha production of monocytes[J].Shock，2001，15（2）：101-105.

[13] Inoue K，Takano H，Shimada A，et al.Urinary trypsin inhibitor protects against systemic inflammation induced by lipopolysacharide[J].Mol Pharmacol，2005，67（3）：673-680.

[14] 余劍波，姚尚龍，袁世熒.烏司他丁對感染性體克患者影響的臨床研究[J].中國急救醫(yī)學，2004，24（2）：135-136.

[15] 陸艷娟，王健春，李曉林，等.烏司他丁對多器官功能衰竭大鼠肝、腎組織氧自由基水平的影響[J].中國老年學雜志，2005，25（10）：1219-1221.

[16] Nakatani K，Takea S，Tsujimoto H，et al.Inhibitory effect of serine protease inhibitors on neutrophil-mediated endothelial cell injury[J].J Leukoc Biol，2001，69（2）：241-247.

（收稿日期：2013-12-27 本文編輯：郭靜娟）

[2] 劉嬌，陳德昌，周青山.烏司他丁對膿毒癥急性腎損傷大鼠腎臟NOD1受體和血IL-18水平的影響[J].臨床外科雜志，2013，21（9）：691-693.

[3] 王虹，劉貴建，劉錦麗，等.烏司他丁對老年多器官功能障礙綜合征器官功能的保護作用[J].中國實用內科學雜志，2007，27（5）：242-244.

[4] Nesek-Adam V，Rasic Z，Kos J，et al.Puninotransferases after experimental pneumoperitoneum in dogs[J].Acta Anaesthesiol Scand，2004，48（7）：862-866.

[5] 桑珍珍，許云，盛英杰，等.重組人紅細胞生成素對膿毒癥大鼠腎臟的保護作用[J].中華腎臟病雜志，2012，28（12）：961-964.

[6] 孟建忠，郭愛華，李丹丹，等.鹽酸法舒地爾防治膿毒癥大鼠急性腎損傷的實驗研究[J].生物醫(yī)學工程研究，2010， 29（3）：197-201.

[7] 任延波.膿毒血癥時腎臟炎癥因子的變化：以大鼠為實驗動物的臨床研究[J].中國急救復蘇與災害醫(yī)學雜志，2008，3（10）：608-710.

[8] 李錦艷，劉虹，辛小梅.內毒素致大鼠急性腎損傷早期NGAL和KIM-1變化[J].中國醫(yī)療前沿，2011，6（9）：18-20.

[9] 王蓓蕾，張瑞，劉妍，等.化學藥物誘導的大鼠急性腎損傷模型中腎損傷分子-1表達的研究[J].天津醫(yī)藥，2012， 40（2）：138-140.

[10] 周芳芳，羅群，蘭凱.KIM-1、NGAL和IL-18聯(lián)合檢測在大鼠缺血再灌注急性腎損傷早期診斷中的意義[J].浙江醫(yī)學，2010，32（8）：1202-1204.

[11] 覃建明.烏司他丁的藥理作用及臨床應用進展[J].中國醫(yī)藥導報，2008，5（11）：19-20.

[12] Aosasa S，Ono S，Mochizuki H，et al.Mechanism of the inhibitory effect of protease inhibitor on tumor necrosis factor alpha production of monocytes[J].Shock，2001，15（2）：101-105.

[13] Inoue K，Takano H，Shimada A，et al.Urinary trypsin inhibitor protects against systemic inflammation induced by lipopolysacharide[J].Mol Pharmacol，2005，67（3）：673-680.

[14] 余劍波，姚尚龍，袁世熒.烏司他丁對感染性體克患者影響的臨床研究[J].中國急救醫(yī)學，2004，24（2）：135-136.

[15] 陸艷娟，王健春，李曉林，等.烏司他丁對多器官功能衰竭大鼠肝、腎組織氧自由基水平的影響[J].中國老年學雜志，2005，25（10）：1219-1221.

[16] Nakatani K，Takea S，Tsujimoto H，et al.Inhibitory effect of serine protease inhibitors on neutrophil-mediated endothelial cell injury[J].J Leukoc Biol，2001，69（2）：241-247.

（收稿日期：2013-12-27 本文編輯：郭靜娟）