李文桔，王樂(lè)丹，呂杰強(qiáng)

（溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院 婦科，浙江 溫州 325027）

·論 著·

噬菌體展示技術(shù)篩選卵巢癌細(xì)胞表面轉(zhuǎn)移相關(guān)分子結(jié)合肽

李文桔，王樂(lè)丹，呂杰強(qiáng)

（溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院 婦科，浙江 溫州 325027）

目的：利用噬菌體7肽庫(kù)篩選高轉(zhuǎn)移潛能卵巢癌細(xì)胞株HO-8910PM表面轉(zhuǎn)移相關(guān)分子結(jié)合肽。方法：利用噬菌體展示技術(shù)體外快速差減篩選（biopanning and rapid analysis of selective interactive ligands，BRASIL）卵巢癌細(xì)胞株HO-8910和HO-8910PM，經(jīng)過(guò)連續(xù)5輪生物淘洗，隨機(jī)挑選14個(gè)噬菌體單克隆進(jìn)行DNA測(cè)序，并進(jìn)行ELISA、噬菌體競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證陽(yáng)性噬菌體的親和性。結(jié)果：噬菌體克隆Z3（短肽LRLRNTR）對(duì)高轉(zhuǎn)移潛能卵巢癌細(xì)胞株HO-8910PM有較高的親和性。結(jié)論：噬菌體展示技術(shù)篩選的短肽LRLRNTR可望為卵巢腫瘤早期診斷、轉(zhuǎn)移復(fù)發(fā)及治療提供新的方向。

卵巢腫瘤；噬菌體展示技術(shù)；噬菌體多肽庫(kù)；多肽

卵巢癌的發(fā)病率僅次于宮頸癌、子宮體癌，是婦科致死率最高的惡性腫瘤[1]。因其發(fā)病隱匿，易擴(kuò)散轉(zhuǎn)移，致使50%～80%停止治療的卵巢癌患者出現(xiàn)轉(zhuǎn)移復(fù)發(fā)，因此5年生存率始終徘徊在25%～30%[2]。雖然CA125已被廣泛用于診斷卵巢癌及監(jiān)測(cè)卵巢癌治療后的復(fù)發(fā)[3-4]。但CA125的特異性不強(qiáng)，盡管大于80%的晚期上皮性卵巢癌患者CA125升高，但在其他生理或病理情況下CA125也會(huì)有升高[5]。因此尋找特異性更強(qiáng)、靈敏度更高的與腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移相關(guān)的分子標(biāo)記物用于卵巢癌的早期診斷、轉(zhuǎn)移復(fù)發(fā)及治療顯得尤為重要。

1985 年Smith[6]創(chuàng)立了噬菌體展示技術(shù)，經(jīng)過(guò)多年的發(fā)展和完善，噬菌體展示技術(shù)在腫瘤抗原篩選、單克隆抗體、藥物研制等[7-10]方面發(fā)揮重要作用，這為研究腫瘤的發(fā)生發(fā)展、診斷及治療提供了新的方向。

本研究主要以低轉(zhuǎn)移潛能卵巢癌細(xì)胞株HO-8910為吸附細(xì)胞，高轉(zhuǎn)移潛能卵巢癌細(xì)胞株HO-8910PM為靶細(xì)胞，利用噬菌體7肽庫(kù)進(jìn)行體外快速差減篩選，從而獲得卵巢癌細(xì)胞株HO-8910PM細(xì)胞表面轉(zhuǎn)移相關(guān)分子結(jié)合肽。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 隨機(jī)肽庫(kù)及主要試劑：噬菌體隨機(jī)7肽庫(kù)（Ph.D-7TM phage display peptide library）購(gòu)自美國(guó)New England Biolabs公司，文庫(kù)滴度為2×1013pfu/mL，隨機(jī)多樣性為1.28×109，受體菌E.coli ER2738，-96 g I I I sequencing primer（5’-HOCCC TCA TAG TTA GCG TAA CG-3’），HRP-抗M13單抗（GE Healthcare.#27-9420-01）。

1.1.2 細(xì)胞來(lái)源：卵巢癌細(xì)胞株HO-8910和HO-8910PM購(gòu)自上海拜力生物科技有限公司，卵巢癌細(xì)胞株SKOV3和胰腺癌細(xì)胞株P(guān)ANC-1購(gòu)自上海中科院。

1.2 方法

1.2.1 差減篩選：消化、收集細(xì)胞HO-8910和HO-8910PM，重懸于含1% BSA的DMEM無(wú)血清培養(yǎng)液，調(diào)整細(xì)胞數(shù)為1×107/mL；取100μL HO-8910細(xì)胞，與噬菌體隨機(jī)7肽庫(kù)10μL孵育2 h（4 ℃，30 r/ min）；將細(xì)胞和噬菌體的混懸液加在200μL鄰苯二甲酸二丁酯與環(huán)己烷組成的有機(jī)分離液上（200μ L、體積比為9:1，密度為1.03 g/mL），10 000 g、4℃離心10 min；取出水相里未結(jié)合的噬菌體與100 μL HO-8910PM細(xì)胞孵育3 h后離心；取出有機(jī)相內(nèi)的沉淀物，轉(zhuǎn)移至200μ L對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的大腸桿菌ER2738，37 ℃孵育30 min復(fù)蘇與HO-8910PM細(xì)胞結(jié)合的噬菌體，測(cè)滴度、擴(kuò)增、純化，再進(jìn)入下一輪差減篩選，如此重復(fù)5個(gè)循環(huán)，測(cè)定每一輪淘洗后和擴(kuò)增后的滴度，計(jì)算回收率（洗脫后的噬菌體滴度/淘洗加入噬菌體滴度）。

1.2.2 DNA測(cè)序和BLAST匹配：取第5輪生物淘洗后噬菌體鋪制的IPTG/X-gal平板，隨機(jī)挑選14個(gè)藍(lán)斑進(jìn)行擴(kuò)增，提取噬菌體DNA，由上海生工公司進(jìn)行測(cè)序分析，通過(guò)DNA測(cè)序結(jié)果推導(dǎo)出多肽序列。通過(guò)網(wǎng)絡(luò)數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行BLAST匹配分析。

1.2.3 噬菌體競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合實(shí)驗(yàn)：分別擴(kuò)增、純化經(jīng)差減篩選所得到的7種噬菌體，測(cè)定擴(kuò)增后的噬菌體滴度，以M13K07為對(duì)照噬菌體，測(cè)定這7種噬菌體與HO-8910PM的相對(duì)結(jié)合效率。如前所述配制HO-8910PM細(xì)胞懸液，分別將待檢測(cè)的噬菌體與M13K07噬菌體按1:1混合分別與100μ L的HO-8910PM細(xì)胞孵育2 h（4 ℃，30 r/min）；離心、復(fù)蘇、測(cè)滴度。由于M13K07噬菌體不含lac-Z基因，故在IPTG/ X-gal平板上顯示白斑，分別計(jì)數(shù)藍(lán)斑和白斑數(shù)目，按照下面的公式計(jì)算待測(cè)噬菌體與HO-8910PM細(xì)胞的相對(duì)結(jié)合效率（產(chǎn)出待測(cè)噬菌體數(shù)目/產(chǎn)出M13K07噬菌體數(shù)目）。

1.2.4 ELISA：將細(xì)胞株（HO-8910PM，SKOV3，PANC-1）以104/孔接種入96孔板；無(wú)血清培養(yǎng)1 h；4%多聚甲醛固定20 min；封閉液（PBS加1% W/V BSA）封閉1 h（每孔200μ L）；分別加入篩選的噬菌體克隆（1010pfu/孔），陰性對(duì)照，PBS和M13K07，37℃孵育2 h（用封閉液稀釋，預(yù)先室溫孵育15～30 min，除去非特異性結(jié)合）；加入HRP-抗M13單抗以1:6 000稀釋于封閉液中（200μL/孔）室溫孵育2 h；最后加入200μ L/孔TMB顯色液，室溫孵育20～60 min顯色，使用微板閱讀器設(shè)置在410 nm。

2 結(jié)果

2.1 差減篩選為了篩選卵巢癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移相關(guān)分子結(jié)合肽，本實(shí)驗(yàn)以HO-8910為吸附細(xì)胞，以HO-8910PM為靶細(xì)胞，利用噬菌體7肽庫(kù)進(jìn)行差減篩選，計(jì)算每一輪的回收率，經(jīng)過(guò)5輪差減篩選，回收率從2.0×10-5增加至4.3×10-5（見(jiàn)表1）。

表1 噬菌體7肽庫(kù)差減篩選HO-8910PM轉(zhuǎn)移相關(guān)分子結(jié)合肽

2.2 DNA序列測(cè)定隨機(jī)挑選14個(gè)噬菌體單克隆進(jìn)行DNA序列測(cè)定，結(jié)果顯示14個(gè)噬菌體克隆包含7種氨基酸序列，其中展示Leu-Arg-Leu-Arg-Asn-Thr-Arg（LRLRNTR）序列的噬菌體被富集（見(jiàn)表2）。

表2 噬菌體克隆序列分析及與HO-8910PM細(xì)胞的相對(duì)結(jié)合效率（±s）

表2 噬菌體克隆序列分析及與HO-8910PM細(xì)胞的相對(duì)結(jié)合效率（±s）

出現(xiàn)頻率噬菌體編號(hào)Z1/7/8 Z3/4/6/11/14 Z2 Z5 Z9 Z10 Z13多肽編號(hào)ZP2 ZP1 ZP3 ZP4 ZP5 ZP6 ZP7氨基酸序列MRMTIIN LRLRNTR KIIRNTR PIKTNRK LNRMLQI IKRSKKM NPMIRRQ 3 5 2 1 1 1 1相對(duì)結(jié)合效率51.7±1.53 69.0±2.65 22.7±2.52 16.3±1.15 14.7±1.53 10.7±0.58 18.3±2.08

2.3 噬菌體競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合實(shí)驗(yàn)以M13K07為內(nèi)參照，測(cè)定篩選出的7種噬菌體與HO-8910PM的結(jié)合效率。結(jié)果顯示所獲得的噬菌體與HO-8910PM細(xì)胞表面的相對(duì)結(jié)合效率明顯高于對(duì)照噬菌體（10.7～69.0倍；平均39.8倍），其中噬菌體Z3與HO-8910PM細(xì)胞表面的結(jié)合效率是對(duì)照噬菌體的69.0倍（見(jiàn)表2）。

2.4 ELISA在ELISA實(shí)驗(yàn)中，OD隨機(jī)克隆/OD陰性對(duì)照克?。≒/N）＞2.1時(shí)，即表示細(xì)胞與此克隆具有高親和力，而本實(shí)驗(yàn)中噬菌體Z1、Z3的P/N＞2.1，且Z3噬菌體的P/N＞7。見(jiàn)圖1。

圖1 ELISA鑒定不同噬菌體克隆與三種腫瘤細(xì)胞的親和力

3 討論

噬菌體展示技術(shù)最大的優(yōu)勢(shì)即實(shí)現(xiàn)了基因型和表型的結(jié)合，因而不需要預(yù)先知道任何肽類結(jié)構(gòu)的信息，通過(guò)對(duì)親和篩選獲得的陽(yáng)性克隆的基因進(jìn)行序列測(cè)定，就可間接推導(dǎo)出所遞呈的外源多肽的氨基酸序列。近年來(lái)以噬菌體展示技術(shù)為手段開(kāi)展抗腫瘤短肽的研究，己經(jīng)取得了一些進(jìn)展。Zhang等[11]用結(jié)腸癌細(xì)胞SW480和人正常的腸上皮細(xì)胞對(duì)噬菌體7肽庫(kù)進(jìn)行多輪篩選，結(jié)果顯示CP15（VHLGYAT）與結(jié)腸癌細(xì)胞SW480結(jié)合率最高，而與正常的腸上皮細(xì)胞幾乎不結(jié)合，為診斷結(jié)腸癌和開(kāi)發(fā)治療結(jié)腸癌藥物奠定了基礎(chǔ)。目前國(guó)內(nèi)外針對(duì)抗卵巢癌短肽的研究只有少數(shù)報(bào)道。Zhang等[12]利用噬菌體隨機(jī)12肽庫(kù)篩選與卵巢癌細(xì)胞SK-OV-3特異性結(jié)合的小分子多肽，得到短肽ZP1（SVSVGMKPSPRP），初步認(rèn)為是卵巢癌靶向治療和靶向診斷的一種配體肽段。

本研究亦采用噬菌體展示技術(shù)，但在此基礎(chǔ)上聯(lián)合應(yīng)用體外快速差減篩選技術(shù)，能有效減少非特異性結(jié)合，提高篩選效率。經(jīng)過(guò)5輪差減篩選，回收率從2.0×10-5增加至4.3×10-5。雖然高于10倍的富集度才是理想的，但高于兩倍常常就是顯著的，從DNA測(cè)序結(jié)果分析來(lái)看也證明存在噬菌體的富集。為進(jìn)一步篩選所獲得的7種陽(yáng)性噬菌體，我們采用噬菌體競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合實(shí)驗(yàn)，以M13K07為內(nèi)參照來(lái)研究陽(yáng)性噬菌體與HO-8910PM細(xì)胞表面的結(jié)合效率，其可明顯克服眾多因素的影響，如加入噬菌體的數(shù)目，細(xì)胞數(shù)量，競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合實(shí)驗(yàn)過(guò)程中離心、復(fù)蘇、測(cè)滴度等，因而可獲得較好的重復(fù)性。隨后利用ELISA鑒定HO-8910PM與噬菌體單克隆親和力，結(jié)果顯示Z1、Z3的P/N＞2.1，且Z3噬菌體的P/N＞7，而同種噬菌體不同腫瘤細(xì)胞之間的OD值之比＜2.1，由于腫瘤細(xì)胞均有轉(zhuǎn)移侵襲的特性，但不同腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移侵襲能力不同，故可以推測(cè)噬菌體Z3與這三種腫瘤細(xì)胞均有較高親和力，尤其對(duì)高轉(zhuǎn)移潛能卵巢癌細(xì)胞株HO-8910PM有較高親和力。

綜上所述，本研究以遺傳背景相同，轉(zhuǎn)移潛能不同的卵巢癌細(xì)胞株差減篩選出的噬菌體Z3，其表面展示的短肽LRLRNTR可能與卵巢癌轉(zhuǎn)移侵襲有關(guān)，可望能為卵巢癌的早期診斷、轉(zhuǎn)移復(fù)發(fā)及治療提供新的方向。未來(lái)我們還可以進(jìn)一步鑒定高轉(zhuǎn)移卵巢癌細(xì)胞表面轉(zhuǎn)移相關(guān)分子結(jié)合肽的生物學(xué)功能，根據(jù)此多肽序列人工合成抗腫瘤藥物或者化學(xué)檢測(cè)藥物，進(jìn)行動(dòng)物體內(nèi)的噬菌體展示實(shí)驗(yàn)等。

[1]王連云, 呂杰強(qiáng), 朱雪瓊, 等. XRCC1和XPD多態(tài)性基因型與上皮性卵巢癌鉑類藥物敏感性的關(guān)系[J]. 溫州醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào), 2013, 43(4): 224-227.

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（本文編輯：吳健敏）

Screening metastasis related peptides binding to the surface of ovarian tumor cells by phage display

LI Wenju, WANG Ledan, LV Jieqiang.Department of Gynecology, the Second Affiliated Hospital of Wenzhou Medical University, Wenzhou, 325027

Objective: Using 7-mer phage display peptide library in vitro to isolate metastasis related peptides on the surface of the high metastatic potential ovarian tumor cell line HO-8910PM.Methods:Phage display technology with biopanning and rapid analysis of selective interactive ligands between cell lines HO-8910 and HO-8910PM was utilized. After five rounds of biopanning, 14 phage clones were randomly selected for sequencing of DNA. Using ELISA and phage competitive binding experiment the affinity of positive phages combined with HO-8910PM cells was identified.Results:The phage clone named Z3 (peptide LRLRNTR) showed higher affinity to HO-8910PM cells.Conclusion:The peptide LRLRNTR screened by phage display technology may offer a new direction for early diagnosis, metastasis and treatment of ovarian tumor.

ovarian tumor; phage display technology; phage peptide library; peptides

R711.75

A

1000-2138（2014）02-0127-04

2013-10-15

李文桔（1988-），女，浙江溫州人，碩士生。

呂杰強(qiáng)，教授，Email：jieqianglu@126.com。