李金海，戴華衛(wèi)，張海峰

（溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第三醫(yī)院 普通外科，浙江 溫州 325200）

·論 著·

RhoA基因在胰腺癌組織中的表達(dá)及其與腫瘤臨床病理特征的關(guān)系

李金海，戴華衛(wèi)，張海峰

（溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第三醫(yī)院 普通外科，浙江 溫州 325200）

目的：探討RhoA基因在胰腺癌組織中的表達(dá)情況及其與胰腺癌臨床病理特征的關(guān)系。方法：應(yīng)用實(shí)時(shí)熒光定量PCR與Western blot同步檢測(cè)48例胰腺癌患者癌組織及對(duì)應(yīng)癌旁組織中RhoA mRNA及蛋白的表達(dá)情況，分析RhoA基因的表達(dá)與胰腺癌組織臨床病理參數(shù)的關(guān)系。結(jié)果：腫瘤組織中RhoA mRNA的表達(dá)量明顯高于癌旁組織（t=3.669，P=0.0007），RhoA mRNA在胰腺癌中的表達(dá)水平與腫瘤分化程度、有無(wú)門脈及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、pTNM病理分期密切相關(guān)，在中、低分化腫瘤（t=2.447，P=0.006）、門靜脈受侵犯（t=2.544，P=0.008）、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移（t=2.351，P=0.041）和pTNM分期較晚（Ⅲ和Ⅳ期，t=2.667，P=0.025）的患者中明顯升高。Western blot結(jié)果顯示腫瘤組織中RhoA蛋白的表達(dá)水平明顯高于癌旁組織（t=3.461，P=0.0003）；RhoA蛋白表達(dá)量與腫瘤侵襲能力以及腫瘤分期相關(guān)，RhoA蛋白的含量在中、低分化腫瘤（t=2.323，P=0.016）、門靜脈受侵犯（t=2.119，P=0.036）、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移（t=2.117，P=0.029）和pTNM分期較晚（Ⅲ和Ⅳ期，t=2.776，P=0.004）的患者中明顯升高。結(jié)論：RhoA基因可能成為一種新的腫瘤標(biāo)志物，用于判斷腫瘤分化程度、轉(zhuǎn)移能力和預(yù)后評(píng)估。

胰腺腫瘤；病理學(xué)，臨床；基因表達(dá)；RhoA

胰腺癌是惡性程度高、病死率高的消化道惡性腫瘤，早期診斷和治療一直是本專業(yè)領(lǐng)域的難題。隨著分子診斷水平的提高，開(kāi)發(fā)早期分子標(biāo)志物以加強(qiáng)對(duì)胰腺癌的早期診斷、治療及預(yù)后判斷是目前研究的重點(diǎn)[1-2]。Rho蛋白屬于小G蛋白超家族的亞家族成員，不僅參與細(xì)胞凋亡過(guò)程，而且決定細(xì)胞凋亡的開(kāi)始[3-4]。RhoA基因與腫瘤浸潤(rùn)轉(zhuǎn)移關(guān)系密切，但其在胰腺癌組織中的研究甚少。本研究目的在于探討RhoA基因在胰腺癌組織中的表達(dá)情況并分析其與胰腺癌臨床病理特征的關(guān)系。

1 材料和方法

1.1 材料選取我院2009-2012年行手術(shù)切除后經(jīng)病理診斷為胰腺癌的標(biāo)本48例，并以癌旁胰腺組織作為對(duì)照。組織學(xué)分級(jí)依據(jù)國(guó)際腫瘤組織學(xué)胰腺癌腫瘤分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)。腫瘤的臨床分期按照國(guó)際抗癌協(xié)會(huì)pTNM分期。

1.2 實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)取所有標(biāo)本的癌組織和癌旁胰腺組織各約40 mg，對(duì)每例標(biāo)本的總RNA進(jìn)行提取。樣品進(jìn)行目的基因的PCR擴(kuò)增，產(chǎn)物做梯度稀釋，用于做標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品。在同一塊96孔板中加入制備好的樣品及標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品。RhoA上游引物序列為5’-GAGCACACAAGGCGGGAG-3’，下游引物序列為5’-TGCCATATCTCTGCCTTCTTCA-3’；探針序列為5’-CCAAGATGAAGCAGGA-GCCGGTGA-3’。PCR循環(huán)條件：50個(gè)循環(huán)內(nèi)50 ℃變性2 min，95 ℃退火10 min，95 ℃延伸30s，60 ℃再延伸30 s。重復(fù)3次。然后把加好樣品的96孔板放在ABI 7700 Sequence Detector（購(gòu)于上?？祷镉邢薰荆┥线M(jìn)行反應(yīng)，對(duì)標(biāo)準(zhǔn)曲線和樣品的質(zhì)量及濃度范圍進(jìn)行檢測(cè)，標(biāo)準(zhǔn)曲線的相關(guān)系數(shù)應(yīng)接近1。樣品定量結(jié)果與βactin（購(gòu)自美國(guó)eBioscience公司）相比為標(biāo)本所測(cè)mRNA濃度。

1.3 Western blot測(cè)定三去污裂解液（購(gòu)自美國(guó)eBioscience公司）提取細(xì)胞總蛋白，所得總蛋白經(jīng)15%聚丙烯酰胺凝膠電泳轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜上，NBT/BCIP顯色，計(jì)算機(jī)掃描蛋白質(zhì)條帶做灰度分析。以β-actin作內(nèi)參照，RhoA/β-actin（灰度值的比值）代表RhoA的相對(duì)表達(dá)量，每個(gè)樣本重復(fù)3次。

1.4 免疫組織化學(xué)染色按常規(guī)方法操作，ABC法染色。RhoA抗體（購(gòu)自美國(guó)Bioworld生物科技有限公司）1:50稀釋。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理方法應(yīng)用SPSS 16.0統(tǒng)計(jì)軟件。數(shù)據(jù)以±s表示，組間比較用Student’s t檢驗(yàn)。P＜0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 RhoA mRNA的表達(dá)通過(guò)實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法對(duì)胰腺癌組織和癌旁胰腺組織中RhoA mRNA的表達(dá)水平進(jìn)行檢測(cè)。圖1顯示胰腺癌組織中RhoA mRNA的表達(dá)量明顯高于癌旁胰腺組織（t=3.669，P=0.0007）。由表1可見(jiàn)RhoA mRNA胰腺癌組織中的表達(dá)水平與腫瘤分化程度、門脈轉(zhuǎn)移、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及pTNM分期相關(guān)，在中、低分化腫瘤、門靜脈受侵犯、有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和pTNM分期較晚（I I I和I V期）的患者中明顯升高（P＜0.05或P＜0.01）。見(jiàn)表1。

表1 胰腺癌的臨床特征與RhoA mRNA和蛋白表達(dá)的關(guān)系

圖1 實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法檢測(cè)胰腺癌和癌旁胰腺組織中RhoA mRNA的表達(dá)

2.2 RhoA蛋白的表達(dá)通過(guò)Western blot對(duì)胰腺癌組織和癌旁胰腺組織中RhoA蛋白的表達(dá)情況進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果顯示胰腺癌組織中RhoA蛋白的表達(dá)水平明顯高于癌旁胰腺組織（t=3.461，P=0.0003）。表1顯示RhoA蛋白的含量在不同腫瘤大小、不同腫瘤灶數(shù)量間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），但在中、低分化腫瘤、門靜脈受侵犯、有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和pTNM分期較晚（I I I和I V期）的患者中明顯升高（P＜0.05或P＜0.01），表明RhoA蛋白的表達(dá)與胰腺癌的分化程度、有無(wú)門靜脈侵犯、有無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及pTNM分期相關(guān)。見(jiàn)表1、圖2。

圖2 Western blot檢測(cè)RhoA蛋白的表達(dá)

2.3 免疫組織化學(xué)染色結(jié)果48例胰腺癌組織中RhoA表達(dá)陽(yáng)性者有35例（占72.9%），癌旁胰腺組織中表達(dá)陽(yáng)性者有21例（占43.8%），胰腺癌組織RhoA蛋白陽(yáng)性率高于癌旁胰腺組織。RhoA蛋白主要沿細(xì)胞膜內(nèi)側(cè)呈線性分布，并在胞漿內(nèi)呈散在棕色顆粒分布，胰腺癌組織表達(dá)主要為彌漫性分布，亦有較多局部或灶性分布，癌旁胰腺組織陽(yáng)性表達(dá)以彌漫性分布為主，局部或灶性分布偏少（見(jiàn)圖3）。

3 討論

圖3 胰腺癌和癌旁胰腺組織中RhoA蛋白的表達(dá)（ABC，×100）

Rho家族蛋白作為一種具有GTP酶活性的小分子G蛋白，含有Rho、Rac、Cdc42三個(gè)亞家族，23個(gè)成員，主要通過(guò)參與調(diào)節(jié)肌動(dòng)蛋白（細(xì)胞骨架）的活動(dòng)、細(xì)胞分裂增殖、細(xì)胞變形的過(guò)程，繼而達(dá)到發(fā)揮調(diào)控腫瘤生長(zhǎng)轉(zhuǎn)移的作用。Rho家族蛋白幾乎參與了腫瘤發(fā)生發(fā)展的每個(gè)環(huán)節(jié)，其中包括調(diào)節(jié)細(xì)胞骨架和細(xì)胞周期，改變細(xì)胞黏附和運(yùn)動(dòng)，改變細(xì)胞轉(zhuǎn)化，參與腫瘤細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移，腫瘤細(xì)胞傳代等。體外實(shí)驗(yàn)表明，Rho家族蛋白可以決定乳腺癌、前列腺癌及宮頸癌等多種腫瘤細(xì)胞的浸潤(rùn)、轉(zhuǎn)移能力[5]。Ariake等[6]實(shí)驗(yàn)證實(shí)GCF2/LRRFIP1通過(guò)整合依賴RhoA蛋白活性來(lái)提高結(jié)腸癌的轉(zhuǎn)移及肝臟浸潤(rùn)能力。此外，在肝癌、頭頸部惡性腫瘤及膀胱癌等多種腫瘤的癌細(xì)胞和細(xì)胞外基質(zhì)中均有RhoA蛋白的高表達(dá)，其高度表達(dá)與腫瘤的遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移、侵襲關(guān)系密切[7-9]。陳碧君等[10]研究發(fā)現(xiàn)，Rho-ROCK細(xì)胞信號(hào)內(nèi)途徑參與胰腺纖維化，并對(duì)慢性胰腺炎、胰腺癌及糖尿病的治療有重要意義。Paul等[11]通過(guò)熒光實(shí)時(shí)影像系統(tǒng)技術(shù)（fluorescence lifetime imaging microscopy-fluorescence resonance energy transfer，F(xiàn)LIM-FRET）檢測(cè)RhoA蛋白活性的研究證實(shí)，突變型P53基因通過(guò)抑制RhoA蛋白活性來(lái)抑制胰腺癌細(xì)胞侵襲及轉(zhuǎn)移。

由于受到病程、個(gè)體情況、治療干預(yù)等因素的影響，要準(zhǔn)確判斷腫瘤組織的侵襲性存在困難，目前也沒(méi)有公認(rèn)的標(biāo)準(zhǔn)。根據(jù)腫瘤的臨床病理特點(diǎn)進(jìn)行分類簡(jiǎn)單易行，而且具有較高的準(zhǔn)確性[12]。因此，本研究中我們按照腫瘤大小、數(shù)目、腫瘤分化程度、有無(wú)門靜脈侵犯、有無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和腫瘤的pTNM分期等條件將所有胰腺癌分為兩組，并應(yīng)用實(shí)時(shí)熒光定量PCR、Western blot技術(shù)檢測(cè)胰腺癌組織和癌旁胰腺組織中RhoA mRNA和蛋白的相對(duì)表達(dá)水平，結(jié)果提示，RhoA在胰腺癌組織中高表達(dá)，其表達(dá)量與胰腺癌的分化程度、門靜脈轉(zhuǎn)移、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移以及pTNM分期相關(guān)。隨著胰腺癌惡性程度及pTNM分期的增高，RhoA蛋白表達(dá)也增加，由此結(jié)果推測(cè)，RhoA蛋白可能參與了胰腺癌的發(fā)生、發(fā)展過(guò)程。Brad等[13]認(rèn)為RhoA蛋白可以通過(guò)血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子誘導(dǎo)血管生成，從而促使腫瘤細(xì)胞向周圍血管侵襲。本研究結(jié)果顯示有門靜脈侵犯或淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的胰腺癌組織中RhoA mRNA和蛋白的表達(dá)量明顯高于無(wú)門靜脈侵犯及無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的胰腺癌組織，提示RhoA基因表達(dá)與胰腺癌的轉(zhuǎn)移能力密切相關(guān)。

綜上所述，RhoA蛋白不但在胰腺癌組織中表達(dá)增高，而且與胰腺癌的分化程度、門靜脈侵犯及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移與否及惡性程度密切相關(guān)。RhoA蛋白及其表達(dá)水平有望作為診斷及評(píng)判胰腺癌惡性程度的腫瘤標(biāo)志物之一。

[1]Yoshimura H, Matsuda Y, Naito Z, et al. Ultra-high-resolution images of nestin and vimentin in pancreatic carcinoma cells using 2 novel microscopy systems[J]. J Nippon Med Sch, 2012, 79(6): 392-393.

[2]Zhang SN, Huang FT, Huang YJ, et al. Characterization of a cancer stem cell-like side population derived from human pancreatic adenocarcinoma cells[J]. Tumori, 2010, 96(6): 985-992.

[3]Park GB, Kim YS, Song H, et al. Cross-linking of CD80 and CD86 diminishes expression of CD54 on EBV-transformed B cells through inactivation of RhoA and Ras[J]. Immune Netw, 2011, 11(6): 390-398.

[4]David M, Petit D, Bertoglio J. Cell cycle regulation of Rho signaling pathways[J]. Cell Cycle, 2012, 11(16): 3003-3010.

[5]Chang YW, Bean RR, Jakobi R. Targeting RhoA/Rho kinase and p21-activated kinase signaling to prevent cancer development and progress[J]. Recent Pat Anticancer Drug Discov, 2009, 4(2): 110-124

[6]Ariake K, Ohtsuka H, Motoi F, et al. GCF2/LRRFIP1 promotes colorectal cancer metastasis and liver invasion through integrin-dependent RhoA activation[J]. Cancer Lett, 2012, 325(1): 99-107.

[7]Gen Y, Yasui K, Zen K, et al. A novel amplification target, ARHGAP5, promotes cell spreading and migration by negatively regulating RhoA in Huh-7 hepatocellular carcinoma cells[J]. Cancer Lett, 2009, 275(1): 27-34.

[8]Croucher DR, Rickwood D, Tactacan CM, et al. Cortactin modulates RhoA activation and expression of Cip/Kip cyclin-dependent kinase inhibitors to promote cell cycle progression in 11q13-amplified head and neck squamous cell carcinoma cells[J]. Mol Cell Biol, 2010, 30(21): 5057-5070.

[9]蔣磊, 趙宏俊, 王思齊, 等. Rho激酶抑制劑對(duì)膀胱癌細(xì)胞侵襲能力的影響[J]. 溫州醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào), 2011, 41(5): 459-461.

[10]陳碧君, 孫子林, 李鳳飛, 等. 胰腺星狀細(xì)胞活化相關(guān)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路[J]. 生命科學(xué), 2010, 24(6): 583-587.

[11]Paul T, Ewan J, Jennifer P. Spatial regulation of RhoA activity during pancreatic cancer cell invasion driven by mutant p53[J]. Cancer Res, 2011, 71(3): 747-757.

[12]王德盛, 李郁, 劉正才, 等. 肝細(xì)胞肝癌中RhoA基因表達(dá)及其與腫瘤臨床病理特征的關(guān)系[J]. 中華普通外科雜志, 2008, 23(12): 918-920.

[13]Brad A, Emily D, Dianne C, et al. RhoA/ROCK signaling is essential for multiple aspects of VEGF-mediated angiogenesis[J]. FASEB J, 2010, 24(9): 3186-3195.

（本文編輯：丁敏嬌）

RhoA gene expression and clinicopathology parameters in pancreatic carcinoma

LI Jinhai, DAI Huawei,

ZHANG Haifeng.Department of General Surgery, the Third Affiliated Hospital of Wenzhou Medical University, Wenzhou, 325200

Objective: To investigate the expression of RhoA gene in tissues of pancreatic cancer and to discuss its significance during carcinogenesis and progression of tumor.Methods:Intratumor RhoA expression level was determined and compared with that in adjacent nontumorous pancreatic tissues using quantitative real time polymerase chain reaction and Western blot in 48 samples of pancreatic carcinoma.Results:The mRNA levels of RhoA were significantly higher in tumor tissues than that in the unaffected portions (t=3.669, P=0.0007). The expression of RhoA mRNA in the primary lesion was higher in patients with low and middle differentiation cancer (t=2.447, P=0.006), protal vein invasion (t=2.544, P=0.008), lymph node metastasis (t=2.351, P=0.041), and advanced pTNM stage (stage III/IV, t=2.667, P=0.025) than in those without. There was a significant difference between high RhoA protein levels in the tumor tissues and noncancerous tissues in pancreatic carcinoma patients(t=3.461, P=0.0003), the quantity of RhoA expression associated with tumor invasion and metastasis. There was a significant association between high tumor RhoA protein levels and low and middle differentiation cancer (t=2.323, P=0.016), and the presence of protal vein invasion (t=2.119, P=0.036), lymph node metastasis (t=2.117, P=0.029), and advanced pTNM stage (t=2.776, P=0.004).Conclusion:There is a significant correlation among RhoA expression, tumor stage, and metastasis. The expression of RhoA can be used as a good tumor marker for invasive and advanced pancreatic carcinoma as well as a prognosis predictor.

pancreatic neoplasms; pathology, clinical; gene expression; RhoA

R735.2

A

1000-2138（2014）02-0130-04

2013-04-27

李金海（1983-），男，山東棗莊人，住院醫(yī)師，碩士。