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(1. 山東出入境檢驗檢疫局檢驗檢疫技術中心,山東青島 266002; 2. 黃島出入境檢驗檢疫局,山東青島 266555)

金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)是一種具有較強抵抗力的人獸共患病原菌,可導致各種疾病和引起皮膚或器官的多種化膿性感染(故它又名為化膿性葡萄球菌),嚴重時可導致敗血癥。我國化妝品衛(wèi)生標準中規(guī)定:在化妝品中不得檢出金黃色葡萄球菌[1]。國內(nèi)外膏霜類化妝品中曾檢出此種細菌,因此,在化妝品中檢測葡萄球菌具有重要的衛(wèi)生意義。

目前我國檢測化妝品中金黃色葡萄球菌主要采用細菌常規(guī)分離培養(yǎng)方法,耗時長[2],需3 ～ 5d,且檢測靈敏度較低,易導致漏檢。采用免疫學檢測方法如乳膠凝集實驗和酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA,enzyme -link immunosorbenr assay),雖可縮短檢測時間,但工作原理是抗原抗體的中和反應,因此會受到樣品成分及葡萄球菌A蛋白的影響,假陽性高。

焦磷酸測序(Pyrosequencing)技術是近年來發(fā)明的一項快速、準確、實時地進行短片段DNA測序技術,目前該技術正廣泛應用于微生物的鑒定[3 - 4]。本研究選取金黃色葡萄球菌保守的nuc基因,以焦磷酸測序法對擴增片段進行準確測序,進行基因序列同源性比對,建立準確檢測化妝品中金黃色葡萄球菌的焦磷酸測序法。

1 材料與方法

1. 1 材料與儀器

實驗菌株如表1所示。

表1 實驗用菌株明細表Table 1 The part list of test strains

SCDLP液體培養(yǎng)基、Baird - Parker平板、血瓊脂培養(yǎng)基、甘露醇發(fā)酵培養(yǎng)基 陸橋公司;PCR擴增引物:上游引物5′ - GGATGGCTATCAGTAATGTTTCG -3′;下游引物5′ - TTAACCGTATCACCATCAATCG - 3′,5′端標記生物素、焦磷酸測序引物:5′ - GATTCAA CAGTATATAGTGC - 3′、GelRed染色液、細菌DNA提取試劑盒、2×GoTaq Master Mix體系 金斯瑞;電泳緩沖液(1×TAE);瓊脂糖(分析純);6×上樣緩沖液:30mmol/L EDTA、36%(體積分數(shù))甘油、0. 05%(質量濃度)二甲苯腈藍FF、0. 05%(質量濃度)溴酚藍;無菌去離子水;焦磷酸測序試劑盒:包括焦磷酸測序用酶、底物及各種dNTP、鏈酶親和素磁珠(Sepharose beads)、綁定緩沖液(Binding Buffer)、復性緩沖液(Annealing Buffer)、變性緩沖液(Denaturation Buffer)、洗液(Washing Buffer);焦磷酸測序儀96孔測序板;微量可調移液器吸頭。

購買的市售化妝品作為檢測驗證材料:妮維雅潤膚霜、wetcode潔面泡泡、相宜本草潤膚霜、Biore潔面泡沫、卡尼爾嫩白潔面乳、東洋之花補水絲滑乳液、李醫(yī)生亮膚水、相宜本草紅景天幼白精華水、蘭皙高水分乳霜、大寶洗面奶。

5331普通PCR儀 Eppendorf;Centrifuge 5415D離心機 Eppendorf,離心速度12000 r/min以上;PyroMark ID檢測系統(tǒng) 瑞典Biotage公司。

1. 2 實驗方法

1. 2. 1 實驗菌株的準備 實驗菌株均使用細菌DNA提取試劑盒提取基因組DNA,存放于 - 20℃,以備PCR特異性擴增和焦磷酸測序驗證用。

1. 2. 2 標準菌株驗證 提取金黃色葡萄球菌和其它非金黃色葡萄球菌細菌基因組DNA進行PCR反應,50μL PCR反應體系:10×PCR buffer 5μL,Taq DNA聚合酶(5U/μL)0. 5μL,上下游擴增引物(20μmol/L)各0. 5μL,dNTPs(10mmol/L)1μL,模板DNA 0. 5μL,雙蒸水補足體積至50μL。

PCR反應條件:94℃預變性5min;94℃變性20s,58℃退火30s,72℃延伸20s,40個循環(huán);72℃延伸5min;4℃保溫。

PCR擴增產(chǎn)物用1. 5%瓊脂糖凝膠(55 ～ 60℃時加入萬分之一GelRed染色液)。取5 ～ 8μL PCR擴增產(chǎn)物,分別與1μL上樣緩沖液混合進行點樣,用DNA分子量標記物做參照。3 ～ 5V/cm恒壓電泳20 ～40min,電泳檢測結果用凝膠成像分析系統(tǒng)記錄并保存(圖1)。結果表明,能夠擴增到金黃色葡萄球菌特異性片斷,而其他非金黃色葡萄球菌無特異性片斷。

1. 2. 3 樣品制備和增菌 參照GB 7918. 1和GB 7918. 5進行樣品的制備和增菌。

1. 2. 4 可疑菌株分離 應用Baird Parker氏培養(yǎng)基或血瓊脂平板,參照GB 7918. 5進行金黃色葡萄球菌的分離。

1. 2. 5 PCR擴增 參考文獻[5 - 6]。

1. 2. 5. 1 模板DNA提取 挑取1. 2. 3的增菌液或1. 2. 4可疑分離菌株,按照細菌DNA提取試劑盒說明提取細菌基因組DNA備用(不能及時檢驗,則放置于 - 20±1℃冰箱保存?zhèn)溆?。

1. 2. 5. 2 PCR擴增 取0. 5μL 1. 2. 5. 1提取的DNA模板,加入10×PCR緩沖液5μL,5U/μL Taq DNA聚合酶0. 25μL,20pmol/μL 上下游引物各0. 5μL,DEPC處理水補足體積至50μL。PCR擴增分別設陽性對照、陰性對照和空白對照,擴增產(chǎn)物長度為247bp。

PCR擴增參數(shù):94℃預變性5min,94℃變性20s,58℃退火30s,72℃延伸20s,50個循環(huán),72℃延伸5min,4 ℃保溫。

PCR產(chǎn)物用1. 5%瓊脂糖凝膠(55 ～ 60℃時加入萬分之一的GelRed核酸染色劑)進行電泳檢測,3 ～ 5V/cm恒壓電泳20 ～ 40min,電泳檢測結果用凝膠成像分析系統(tǒng)記錄保存。

1. 2. 6 焦磷酸測序 參考文獻[7 - 9]。

1. 2. 6. 1 測序單鏈模板的制備 將50μL PCR產(chǎn)物轉移至96孔測序板中,在產(chǎn)物中分別加入磁珠3μL和綁定緩沖液47μL,常溫混勻10min。

打開真空泵,將真空吸附器在超純水中清洗30s后移到96孔測序板中,抓取與磁珠結合后的PCR產(chǎn)物,分別在70%乙醇中清洗5 ～ 10s、變性緩沖液中變性5s、洗滌緩沖液中清洗5 ～ 10s。關閉真空泵,將磁珠釋放入96孔測序板中,該板中預先加入1μL 20pmol/μL測序引物和44μL退火緩沖液。

將96孔測序板置80℃烘箱2min后,取出冷卻至室溫進行焦磷酸測序反應。

1. 2. 6. 2 焦磷酸測序反應 設定測序程序,堿基的加入為ATCG 6 ～ 10個重復,根據(jù)程序給定劑量(該劑量根據(jù)樣本數(shù)的多少而定,由儀器程序自動給出),在試劑艙中加入酶混合物、底物混合物以及四種dNTP(dATP、dCTP、dTTP、dGTP),將試劑艙和96孔測序板放入機箱中進行反應。

測序反應在28±1℃下于焦磷酸測序儀上進行,加樣使用600mbar/8msec的加樣壓力和時間,每輪反應時間65s。引物鏈隨著不同dNTP的加入而延伸。隨著核酸的結合,CCD攝像機檢測到發(fā)出的光信號,讀出DNA序列。

1. 2. 6. 3 結果判定 測序目標序列為:AACTTCAACTAAAAAATTAC。焦磷酸測序結果或與測序結果目標序列不一致,則判斷為陰性。焦磷酸測序結果與目標序列完全一致,則判斷為陽性。

1. 2. 6. 4 雜菌干擾實驗 分別吸取1mL 10個/mL的金黃色葡萄球菌ATCC6538、表皮葡萄球菌、巴氏葡萄球菌、奇異變形桿菌增菌液至90mL SCDLP中增菌16 ～ 18h進行干擾實驗,各吸取1mL 10個/mL表皮葡萄球菌、巴氏葡萄球菌、奇異變形桿菌增菌液至90mL SCDLP增菌做陰性對照。吸取1mL培養(yǎng)液,提取基因組DNA,進行PCR和焦磷酸測序測試。

2 結果與分析

2. 1 標準菌株驗證

對金黃色葡萄球菌陽性和標準菌株PCR擴增產(chǎn)物進行電泳檢測,結果表明PCR體系能擴增到金黃色葡萄球菌特異性片斷,而其他非金黃色葡萄球菌無特異性片斷(圖1)。

圖1 PCR擴增結果Fig. 1 The results of PCRs注:各條帶從左向右依次為DL500、金黃色葡萄球菌:J - 1、J - 2、J - 3、J - 4、J - 5、ATCC6538、表皮葡萄球菌GIMT1. 126、巴氏葡萄球菌GIMT1. 058、單核細胞增生李斯特氏菌ATCC 7644、DL500。

2. 2 特異性和重現(xiàn)性驗證實驗

提取39株金黃色葡萄球菌以及30株非金黃色葡萄球菌的基因組DNA,按照上述PCR檢測步驟進行特異性實驗,結果如圖2所示,擴增引物針對金黃色葡萄球菌的特異性、靈敏度、重現(xiàn)性良好,其他菌株DNA沒有擴增出目的條帶。

2. 3 雜菌干擾實驗

雜菌干擾結果表明,PCR引物能夠有效去除雜菌干擾,能夠有效擴增出目的片段(圖3)。

2. 4 利用化妝品進行方法驗證

通過添加不同濃度的金黃色葡萄球菌至化妝品中,根據(jù)GB 7918. 1和7918. 5進行樣品的制備和增菌,對增菌液進行PCR擴增并進行焦磷酸測序,結果表明,添加濃度10個/g(mL)(因樣品的質地不同,單位不一樣,潤膚霜用克計量,亮膚水用mL計量)以上的增菌液,皆能擴增出目的條帶,添加濃度為1個/g(mL)只有部分能夠擴增出來目的條帶,和常規(guī)分離結果一致;并且只要PCR為陽性的樣品,焦磷酸測序結果也為陽性(表2)。

表2 化妝品添加金黃色葡萄球菌方法驗證結果Table 2 Method validation results in cosmetics added with S. aureus

圖2 金黃色葡萄球菌和非金黃色葡萄球菌PCR擴增結果Fig. 2 PCR amplification results of S. aureaus and other bacteria strain

圖3 雜菌干擾實驗結果Fig. 3 Bacterial interference results注:從左到右依次為分子標準DL500、添加干擾菌(干擾菌為表皮葡萄球菌、巴氏葡萄球菌、奇異變形桿菌)、純干擾菌、陽性對照ATCC6538、空白。

注:括號外結果為PCR結果,括號內(nèi)結果為焦磷酸測序結果。

2. 5 焦磷測序結果

對上述擴增結果為陽性和陰性的PCR產(chǎn)物進行焦磷酸測序,實驗結果表明(表2和圖4):只有PCR結果為陽性的樣品測序結果為陽性,其測序結果皆為AACTTCAACTAAAAAATTAC,可確定樣品中檢出金黃色葡萄球菌。金黃色葡萄球菌(ATCC 6538)、添加干擾菌實驗、靈敏度實驗樣品(相宜本草紅景天幼白精華水1個/mL添加樣品、卡尼爾嫩白潔面乳10個/g添加樣品)進行焦磷酸測序結果表明,能夠快速對可疑金黃色葡萄球菌進行測序結果判定。

圖4 部分焦磷酸測序結果Fig. 4 A part of pyrosequencing results

3 結論和討論

病菌檢測的傳統(tǒng)方法為生化培養(yǎng)法,但隨著各種化妝品安全問題的不斷發(fā)生,生化培養(yǎng)的時間問題嚴重影響了檢測進程和結果判定,因此各種快速檢測技術不斷涌現(xiàn),免疫學法、測試片法、PCR方法、LAMP技術等等[9],但這些快檢技術都存在著自身的不足之處,如,免疫學方法假陰性高,人為要求操作水平影響較大[10 - 11;測試片儲存時間極短,一旦開封剩余測試片儲存時間最多兩個月,且不易保存;PCR 方法存在氣溶膠污染;LAMP方法,易出現(xiàn)假陰性、假陽性的結果,且結果不易穩(wěn)定,因此,測序技術是目前相關技術中最本質的從基因序列水平判讀結果的方法,可靠性大大增強。

本研究采用PCR擴增和焦磷酸測序相結合的方法,通過采用特異的測序引物對金黃色葡萄球菌保守基因nuc基因進行焦磷酸測序,從而建立化妝品中金黃色葡萄球菌的焦磷酸測序檢測方法,結果表明,測序結果皆為AACTTCAACTAAAAAATTAC,能快速(4h以內(nèi))可靠地鑒定鑒別金黃色葡萄球菌。焦磷酸測序檢測金黃色葡萄球菌的方法吸收了PCR和DNA測序技術兩方面的優(yōu)勢,在PCR特異性的基礎上,應用很短的一段保守/特異序列的測定就可滿足對分子診斷的需要。

本方法建立的焦磷酸測序體系能夠非常準確地對nuc基因進行測序,以此序列對金黃色葡萄球菌進行快速鑒定,提高了檢測的特異性和效率,給出了分子診斷的黃金標準 - 基因序列,減少了由于PCR敏感性高而出現(xiàn)的假陽性結果,提高了檢測的準確性,可以對目標生物實現(xiàn)快速、實時、高通量、準確鑒定[4]。

[1]GB 7916 - 1987 化妝品衛(wèi)生標準[S].

[2]GB 7918. 5 - 1987 化妝品微生物標準檢驗方法 金黃色葡萄球菌[S].

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[4]李秀娟,徐保紅,田會方,等. 焦磷酸測序法檢測單增李斯特菌[J]. 中國衛(wèi)生檢驗雜志,2010,20(7):1623 - 1625.

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