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(1. 大連工業(yè)大學(xué)食品學(xué)院,遼寧大連 116034; 2. 大連民族學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院,遼寧大連 116600; 3. 大連理工大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院,遼寧大連 116024)

單核細(xì)胞增多性李斯特菌(Listeriamonocytogenes)是一種能引起人畜共患的食源性致病菌,多通過食品經(jīng)口感染,該菌已被列為二十世紀(jì)90年代四大食品致病菌之一,成為許多國(guó)家食品衛(wèi)生的必檢項(xiàng)目,其可誘發(fā)食物中毒,導(dǎo)致李斯特菌病,主要引起人類腦膜炎、敗血癥等,發(fā)病率雖低,致死率卻高達(dá)30%。鮮切果蔬作為即食性食品,易受微生物污染,而目前國(guó)內(nèi)關(guān)于此方面研究鮮有報(bào)道,但近年常有單核細(xì)胞增多性李斯特菌污染果蔬類食品而導(dǎo)致人體患病的現(xiàn)象。因此,本研究以此為切入點(diǎn),選取鮮切甜瓜為材料,進(jìn)行了熒光定量PCR快速檢測(cè)單核細(xì)胞增多性李斯特菌的初步研究。本研究根據(jù)單核細(xì)胞增多性李斯特菌的hly基因序列所設(shè)計(jì)的簡(jiǎn)并引物和探針特異性良好,可檢測(cè)多種不同來源的單核細(xì)胞增多性李斯特菌,靈敏度較高,為鮮活農(nóng)產(chǎn)品的質(zhì)量與安全控制研究提供技術(shù)支持。

1 材料與方法

1. 1 材料與儀器

單核細(xì)胞增多性李斯特菌(ATCC 19111、ATCC 19112、ATCC 19115、ATCC 15313)、英諾克李斯特氏菌ATCC 33090、格氏李斯特氏菌ATCC 25401、伊氏李斯特氏菌ATCC 19119、威氏李斯特氏菌ATCC 35897、斯氏李斯特氏菌ATCC 35967 中國(guó)工業(yè)微生物菌種保藏管理中心;單核細(xì)胞增多性李斯特菌GIM 1. 229 北京北納創(chuàng)聯(lián)生物技術(shù)研究院;大腸埃希氏菌O157∶ H7 NCTC 12900、大腸埃希氏菌ATCC 8739、金黃色葡萄球菌ATCC 6538、乙型副傷寒沙門氏菌CMCC(B)50094、傷寒沙門氏菌CMCC(B)50071、鼠傷寒沙門氏菌ATCC 14028、痢疾志賀氏菌CMCC(B)51105、藤黃微球菌CMCC(B)28001、蠟樣芽孢桿菌CMCC(B)63301、奇異變形桿菌CMCC(B)49005 中國(guó)微生物菌種網(wǎng);核酸純化試劑盒、pMD18 - T Vector、DH5α感受態(tài)細(xì)胞、小量質(zhì)粒提取試劑、Premix Ex TaqTM(Probe qPCR) 寶生物工程(大連)有限公司;磁珠法細(xì)菌DNA提取試劑盒 北京普華仕科技發(fā)展有限公司。

實(shí)驗(yàn)材料為附近超市中鮮切的伊麗莎白瓜。

Thermo Scientific PikoReal 實(shí)時(shí)PCR儀、Thermo Scientific Arktik 熱循環(huán)儀 Thermo公司。

1. 2 引物及探針的設(shè)計(jì)

根據(jù)從NCBI中下載的多條單核細(xì)胞增多性李斯特菌hly基因序列,用Primer5. 0進(jìn)行引物和探針設(shè)計(jì),且找出簡(jiǎn)并堿基,預(yù)計(jì)擴(kuò)增產(chǎn)物長(zhǎng)度為180bp,由寶生物工程(大連)有限公司合成引物和探針。簡(jiǎn)并引物上游:5′ - GGATGAARTAAATTATGATCC - 3′;下游:5′ - ATCAATTACCGTTCTCCAC - 3′;探針:5′ -(FAM)GCACTGGTTTAGCTTGGGAATGG(Eclipse) - 3′。

1. 3 細(xì)菌DNA的提取

取1mL 37℃過夜培養(yǎng)的單核細(xì)胞增多性李斯特菌菌液,12000r/min離心2min,菌沉淀按照磁珠法細(xì)菌DNA提取試劑盒的操作說明提取基因組。通過紫外分光光度計(jì)測(cè)定OD260、OD280值后確定提取DNA的濃度及純度,根據(jù)測(cè)得的OD260值換算成DNA濃度,根據(jù)OD260/OD280確定DNA純度,一般認(rèn)為比值在1. 8 ～ 2. 0之間適宜。

1. 4 質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品的構(gòu)建

以提取的單核細(xì)胞增多性李斯特菌基因組DNA為模板,用簡(jiǎn)并引物對(duì)其進(jìn)行PCR擴(kuò)增,切膠回收、純化擴(kuò)增產(chǎn)物,擴(kuò)增產(chǎn)物與載體pMD18 - T連接后轉(zhuǎn)化至大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞中,涂板篩選,疑似陽(yáng)性的菌落進(jìn)行培養(yǎng)后,抽提質(zhì)粒,進(jìn)行PCR擴(kuò)增,鑒定為陽(yáng)性重組質(zhì)粒的送往寶生物工程(大連)有限公司進(jìn)行測(cè)序。用紫外分光光度法進(jìn)行純度和濃度的分析后,10倍倍比梯度稀釋作為標(biāo)準(zhǔn)品。

1. 5 熒光定量PCR反應(yīng)體系和反應(yīng)條件

本實(shí)驗(yàn)所采用的反應(yīng)體系為20μL:Premix Ex TaqTM(Probe qPCR)10μL,上游引物(10μmol/L)0. 8μL,下游引物(10μmol/L)0. 8μL,探針1μL,模板2. 0μL,無菌水5. 4μL。反應(yīng)條件為:95℃,30s預(yù)變性;95℃,30s;60℃,30s;擴(kuò)增40個(gè)循環(huán)。

1. 6 引物的特異性驗(yàn)證

根據(jù)1. 4提取5株單核細(xì)胞增多性李斯特菌和15株非單核細(xì)胞增多性李斯特菌基因組,以其作為模板,且設(shè)無菌水為陰性對(duì)照,按照1. 5進(jìn)行熒光定量PCR擴(kuò)增,驗(yàn)證引物特異性。

1. 7 標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立及靈敏度的確定

方法1. 4制備的質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品濃度為1. 12×109～1. 12copies/μL,作為模板,按照1. 5進(jìn)行熒光定量PCR擴(kuò)增,以模板的拷貝數(shù)為橫坐標(biāo),以其對(duì)應(yīng)的循環(huán)閾值(Cq值)為縱坐標(biāo),建立標(biāo)準(zhǔn)曲線,并確定靈敏度。

1. 8 染菌鮮切甜瓜最低檢出限的確定

將單核細(xì)胞增多性李斯特菌接種于5mL TSBYE培養(yǎng)基中,37℃過夜培養(yǎng),取1mL菌液噴于稱取的25g鮮切甜瓜上,加入225mL TSBYE,37℃增菌過夜。用均質(zhì)器拍打后,取均質(zhì)液,用1%的蛋白胨水進(jìn)行10倍倍比稀釋。取各稀釋度的菌液涂平板,37℃培養(yǎng)24h后進(jìn)行菌落計(jì)數(shù)。同時(shí)再取上述各稀釋度的菌液1mL,12000r/min離心2min,菌沉淀按照1. 3提取基因組DNA,然后按照1. 5進(jìn)行熒光定量PCR擴(kuò)增。

2 結(jié)果與分析

2. 1 重組質(zhì)粒的鑒定

重組質(zhì)粒通過PCR和酶切鑒定后,將陽(yáng)性重組質(zhì)粒送往寶生物工程(大連)有限公司測(cè)序后,與NCBI網(wǎng)站上進(jìn)行在線BLAST比對(duì)分析,結(jié)果表明擴(kuò)增產(chǎn)物與單核細(xì)胞增多性李斯特菌的hly基因相應(yīng)區(qū)域99%同源。

2. 2 熒光定量PCR特異性檢測(cè)

用建立的熒光定量PCR方法檢測(cè)5株單核細(xì)胞增多性李斯特菌和15株非單核細(xì)胞增多性李斯特菌菌株,結(jié)果見圖1。由圖1可知,5株單核細(xì)胞增多性李斯特菌均有擴(kuò)增曲線生成,結(jié)果為陽(yáng)性,且循環(huán)閾值均小于30,其它15株非單核細(xì)胞增多性李斯特菌菌株及陰性對(duì)照無菌水的檢測(cè)結(jié)果為陰性,表明建立的熒光定量PCR方法特異性良好。

圖1 特異性擴(kuò)增曲線Fig. 1 Primary curve of specificity注:1:單核細(xì)胞增多性李斯特菌ATCC 19111;2:單核細(xì)胞增多性李斯特菌ATCC 15313;3:單核細(xì)胞增多性李斯特菌ATCC 19115;4:單核細(xì)胞增多性李斯特菌ATCC 19112;5:單核細(xì)胞增多性李斯特菌GIM 1. 229。

2. 3 標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立及靈敏度的確定

以質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品作為模板,進(jìn)行熒光定量PCR擴(kuò)增,獲得熒光定量PCR擴(kuò)增曲線,見圖2。根據(jù)得到擴(kuò)增曲線,以各質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品拷貝數(shù)的對(duì)數(shù)為橫坐標(biāo),以其對(duì)應(yīng)的Cq值為縱坐標(biāo),建立標(biāo)準(zhǔn)曲線,見圖3。由圖3可知,Cq值和各質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品拷貝數(shù)的對(duì)數(shù)具有良好的線性關(guān)系,標(biāo)準(zhǔn)曲線相關(guān)系數(shù)為R2=0. 9912,線性方程為:y= - 4. 313x+52. 182。

圖2 質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品擴(kuò)增曲線Fig. 2 Primary curve of plasmid standards注:1:質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品濃度為1. 12×109copies/μL;2:質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品濃度為1. 12×108copies/μL;3:質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品濃度為1. 12×107copies/μL;4:質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品濃度為1. 12×106copies/μL;5:質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品濃度為1. 12×105copies/μL;6:質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品濃度為1. 12×104copies/μL;7:質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品濃度為1. 12×103copies/μL;8:質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品濃度為1. 12×102copies/μL。

圖3 標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig. 3 Standard curve

由圖2可以得出,當(dāng)質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品的濃度為1. 12×102copies/μL時(shí),仍有擴(kuò)增曲線出現(xiàn),表明該方法的單核細(xì)胞增多性李斯特菌的靈敏度為1. 12×102copies/μL。

2. 4 染菌鮮切甜瓜最低檢出限的確定

方法1. 8中染菌的鮮切甜瓜原菌液及各稀釋度菌液的菌落計(jì)數(shù)結(jié)果為約6. 28×108～ 6. 28×100、0cfu/mL,以其作為模板,按照1. 5進(jìn)行熒光定量PCR擴(kuò)增,結(jié)果如圖4所示,菌液濃度過高或過低均不會(huì)擴(kuò)增出S曲線,菌濃度為6. 28×102cfu/mL時(shí)仍有擴(kuò)增曲線,表明該方法對(duì)鮮切甜瓜中單核細(xì)胞增多性李斯特菌的最低檢出限為6. 28×102cfu/mL。以菌濃度的對(duì)數(shù)為橫坐標(biāo),以其對(duì)應(yīng)的Cq值為縱坐標(biāo),建立標(biāo)準(zhǔn)曲線,見圖5。標(biāo)準(zhǔn)曲線的相關(guān)系數(shù)為R2=0. 9939,表示線性關(guān)系良好,線性方程為:y= - 4. 331x+49. 693。

圖4 染菌鮮切甜瓜的熒光定量PCR擴(kuò)增曲線Fig. 4 Primary curve of real time PCR of artificial contamination fresh cut melon注:1:濃度為6. 28×108cfu/mL;2:濃度為6. 28×107cfu/mL;3:濃度為6. 28×106cfu/mL;4:濃度為6. 28×105cfu/mL;5:濃度為6. 28×104cfu/mL;6:濃度為6. 28×103cfu/mL;7:濃度為6. 28×102cfu/mL。

圖5 標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig. 5 Standard curve

3 討論

單核細(xì)胞增多性李斯特菌在自然界分布廣泛,對(duì)環(huán)境的耐受性較強(qiáng),可以造成多種食品污染,如奶制品、肉制品、水產(chǎn)品、新鮮蔬菜等植物性食品[1]。近些年,食品污染單核細(xì)胞增多性李斯特菌而導(dǎo)致的食物中毒爆發(fā)事件日見增多。2002年法國(guó)一家公司加工生產(chǎn)的部分肉醬和豬舌受到單核細(xì)胞增多性李斯特菌污染,導(dǎo)致9人感染,2人死亡[2]。2008年8月,加拿大共發(fā)生57起單核細(xì)胞增多性李斯特菌感染事件,造成23人死亡。由于單核細(xì)胞增多性李斯特菌在肉類及其加工產(chǎn)品中污染的相關(guān)報(bào)道較多,故研究人員針對(duì)肉類及其制品、奶類等高蛋白、高脂肪食品中污染單核細(xì)胞增多性李斯特菌的研究偏多[3 - 8],而對(duì)于蔬菜、水果等植物性食品的研究很少。但是2011年9月美國(guó)爆發(fā)的大規(guī)模的甜瓜李斯特菌中毒事件即刻引起專家學(xué)者的注意,該事件導(dǎo)致全美24個(gè)州出現(xiàn)李斯特菌感染病例,截止2011年12月,30人確認(rèn)因感染李斯特菌死亡[9]。這表明植物性食品也同樣存在由于污染單核細(xì)胞增多性李斯特菌而對(duì)人體健康造成危害的危險(xiǎn),所以應(yīng)提高重視。而鮮切果蔬作為即食性食品,存在新鮮、健康、衛(wèi)生、方便等優(yōu)點(diǎn),深受人們青睞,但同時(shí)其易受微生物污染等問題同樣急需解決。本研究以此為切入點(diǎn),選取鮮切甜瓜為材料,進(jìn)行了熒光定量PCR快速檢測(cè)單核細(xì)胞增多性李斯特菌的初步研究。

熒光定量PCR快速檢測(cè)食品中單核細(xì)胞增多性李斯特菌的關(guān)鍵是選擇合適的靶基因,設(shè)計(jì)合適的引物和探針。根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道,在單核細(xì)胞增多性李斯特菌的熒光定量PCR檢測(cè)中,研究學(xué)者們選擇擴(kuò)增的靶基因、使用的引物和探針各不相同[10 - 15]。而選擇較多的靶基因hly為單核細(xì)胞增多性李斯特菌所特有,且在不同菌株之間具有較高的保守性。因此,本研究選擇hly基因作為熒光定量PCR反應(yīng)的靶基因。從GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中下載多條不同來源的hly基因序列,通過DNAMAN軟件比對(duì)后進(jìn)行引物和探針設(shè)計(jì),找出簡(jiǎn)并堿基,合成簡(jiǎn)并引物和探針。很少有相關(guān)文獻(xiàn)關(guān)于設(shè)計(jì)兼并引物的報(bào)道,本研究設(shè)計(jì)的簡(jiǎn)并引物可對(duì)不同來源的單核細(xì)胞增多性李斯特菌進(jìn)行檢測(cè),擴(kuò)大食品中單核細(xì)胞增多性李斯特菌的檢測(cè)范圍。

同時(shí),模板DNA的提取也非常關(guān)鍵,提取質(zhì)量直接影響到檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性。要獲得可靠的檢測(cè)結(jié)果,很大程度上取決于模板DNA的純度和濃度。目前大多數(shù)的提取DNA的方法為熱裂解法、飽和苯酚 - 氯仿提取法、Chelex - 100樹脂提取法、細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒法等。但這些方法都存在操作繁瑣或提取質(zhì)量差等問題。本研究采用的磁珠法提取基因組的方法具有方便快捷、提取質(zhì)量高等特點(diǎn),其得到的模板DNA的純度在1. 8 ～ 2. 0之間,濃度較高,與預(yù)實(shí)驗(yàn)中細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒法得到的結(jié)果相比較好于前者,表明該方法更適用于模板DNA的提取。

本研究利用所設(shè)計(jì)的引物和探針定量PCR擴(kuò)增5株單核細(xì)胞增多性李斯特菌,在30個(gè)循環(huán)內(nèi)均產(chǎn)生了擴(kuò)增曲線,為陽(yáng)性。而同時(shí)定量擴(kuò)增其他15株非單核細(xì)胞增多性李斯特菌為陰性。說明建立的熒光定量PCR方法具有較好的特異性。上述建立的熒光定量PCR方法也具有較高的靈敏度,可檢測(cè)到1. 12×102copies/μL的質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品,在染菌的鮮切甜瓜樣品檢測(cè)中,最低檢出限為6. 28×102cfu/mL,與張紅娟[16]等人建立的實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法檢測(cè)蜂王漿和蜂蜜產(chǎn)品中的單核細(xì)胞增生李斯特菌的靈敏度(103cfu/mL和102cfu/mL)一致,符合國(guó)際上一般認(rèn)為即食食品中單核細(xì)胞增多性李斯特菌的限量標(biāo)準(zhǔn)102cfu[17]。

本研究建立的熒光定量PCR檢測(cè)方法實(shí)現(xiàn)了在染菌鮮切甜瓜樣品中的初步應(yīng)用,為保障鮮切果蔬的食品安全奠定了基礎(chǔ)。雖然目前關(guān)于單核細(xì)胞增多性李斯特菌污染果蔬類而對(duì)人類致病的報(bào)道不多,但仍應(yīng)該予以高度重視,深入研究快速檢測(cè)方法,確保鮮活農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全,實(shí)現(xiàn)防患于未然。

[1]丁建英,韓劍眾. 食品中單增李斯特菌的存在現(xiàn)狀及檢測(cè)方法研究進(jìn)展[J]. 食品研究與開發(fā),2008,29(12):171 - 174.

[2]田霞,李遠(yuǎn)釗,張培正. 李斯特菌的污染現(xiàn)狀及控制措施[J]. 現(xiàn)代食品科技,2005,21(1):160 - 162.

[3]邵美麗,董鑫,趙燕麗,等. 單增李斯特菌和金黃色葡萄球菌雙重?zé)晒舛縋CR檢測(cè)方法建立與初步應(yīng)用[J]. 食品科學(xué),2013,(16):169 - 172.

[4]吳曉芳,韓建康,紀(jì)蕾,等. 多重實(shí)時(shí)熒光PCR快速檢測(cè)沙門菌和單增李斯特菌[J]. 疾病監(jiān)測(cè),2011,26(3):234 - 237.

[5]閆冰,姜毓君,曲妍妍,等. 實(shí)時(shí)RT - PCR檢測(cè)存活于乳中的單核細(xì)胞增多性李斯特菌[J]. 食品科學(xué),2008,29(2):292 - 296.

[6]劉仲敏,鄭鳴,王永芬. 食源性單增李斯特菌的實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)[J]. 食品與發(fā)酵工業(yè),2007,33(5):100 - 104.

[7]Rantsiou K,Alessandria V,Urso R,etal. Detection,quantification and vitality ofListeriamonocytogenesin food as determined by quantitative PCR[J]. International Journal of Food Microbiology,2008,121:99 - 105.

[8]Vanegas M C,Vasquez E,Martinez A J,etal. Detection ofListeriamonocytogenesin raw whole milk for human consumption in Colombia by real - time PCR[J]. Food Control,2009,20:430 - 432.

[9]關(guān)棣鍇,胡文忠,姜愛麗,等. 鮮活農(nóng)產(chǎn)品中單核細(xì)胞增多性李斯特菌快速檢測(cè)技術(shù)的研究進(jìn)展[J]. 食品工業(yè)科技,2013,(11):361 - 368.

[10]梅玲玲,王晶,孟真,等. TaqMan - MGB探針Real - time PCR快速檢測(cè)單增李斯特菌的研究[J]. 中國(guó)衛(wèi)生檢驗(yàn)雜志,2007,17(2):211 - 213.

[11]徐德順,查赟峰. 食品中單核細(xì)胞增生李斯特菌實(shí)時(shí)熒光PCR 快速檢測(cè)方法的建立[J]. 中國(guó)人獸共患病學(xué)報(bào),2007,23(4):380 - 383.

[12]Peter Rossmanith,Martina Krassnig,Martin Wagner,etal. Detection ofListeriamonocytogenesin food using a combined enrichment/real - time PCR method targeting the prfA gene[J]. Research in Microbiology,2006,(157):763 - 771.

[13]Hassan Dadkhah,Mohammad Reza Bassami,Saeed Hashemi,etal. Evaluation and comparison of SYBR Green I Real- Time PCR and TaqMan Real - Time PCR methods for quantitative assay ofListeriamonocytogenesin nutrient broth and milk[J]. African Journal of Microbiology Research,2012,6(9):1908 - 1917.

[14]Jaime Navas,Sagrario Ortiz,Pilar Lopez,etal. Evaluation of Effects of Primary and Secondary Enrichment for the Detection ofListeriamonocytogenesby Real - Time PCR in Retail Ground Chicken Meat[J]. Food Borne Pathogens and Disease,2004,3(4):347 - 354.

[15]Justin O’ Grady,Margaret Ruttledge,Sara Sedano - Balba’s,etal. Rapid detection ofListeriamonocytogenesin food using culture enrichment combined with real - time PCR[J]. Food Microbiology,2009,(26):4 - 7.

[16]張紅娟,李素芳,李白,等. 單核細(xì)胞增生李斯特菌在蜂產(chǎn)品中的生存及檢測(cè)[J]. 中國(guó)食品學(xué)報(bào),2012,12(4):175 - 181.

[17]Elena Carrasco,Fernando P′erez - Rodr′guez,Antonio Valero,etal. Risk Assessment and Management ofListeriaMonocytogenesin Ready - to - Eat Lettuce Salads[J]. Comprehensive Reviews in Food Science and Food Safety,2010(9):498 - 512.