，，

(青島大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬青島市立醫(yī)院普外科，山東 青島 266071)

神經(jīng)前體細(xì)胞發(fā)育下調(diào)表達(dá)蛋白(NEDD9)是CAS 家族成員之一。近年研究顯示，NEDD9在乳癌、侵襲性黑色素瘤、肺癌、宮頸癌等惡性腫瘤組織中呈高表達(dá)狀態(tài)[1-6]，并且與腫瘤的侵襲轉(zhuǎn)移密切相關(guān)；NEDD9的作用與細(xì)胞的黏附、遷移、侵襲、細(xì)胞凋亡和上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)有關(guān)[1,7]；NEDD9與非小細(xì)胞肺癌預(yù)后相關(guān)，高表達(dá)的NEDD9可以作為一個(gè)獨(dú)立的判斷預(yù)后的指標(biāo)[8]。NEDD9可以作為預(yù)測(cè)腫瘤病人預(yù)后的標(biāo)記物，但NEDD9在結(jié)直腸癌侵襲轉(zhuǎn)移及預(yù)后中的作用尚不清楚。本文應(yīng)用免疫組化方法，檢測(cè)NEDD9在結(jié)直腸癌組織中的表達(dá)情況，并分析其與預(yù)后的關(guān)系。

1 資料與方法

1.1 一般資料

2007年1月—2008年9月，選取在我科行手術(shù)治療、術(shù)后病理確診為結(jié)直腸癌組織及其正常組織(距腫瘤組織距離>5 cm)標(biāo)本各92例。其中男52例，女40例；年齡23～82歲，平均62歲。術(shù)后病理類(lèi)型：黏液腺癌12例，管狀腺癌77例，乳頭狀腺癌3例。腫瘤部位：57例位于乙狀結(jié)腸或直腸，26例位于右半結(jié)腸，9例位于左半結(jié)腸。腫瘤分期：Ⅰ期15例,Ⅱ期30例,Ⅲ期37例,Ⅳ期10例。所有病例均為原發(fā)腫瘤，臨床病理資料及隨訪(fǎng)資料完整，通過(guò)電話(huà)或門(mén)診方式隨訪(fǎng)止2013年9月。平均隨訪(fǎng)時(shí)間51.2個(gè)月，失訪(fǎng)5例，失訪(fǎng)率5.4%。腫瘤分期參照2012版美國(guó)結(jié)直腸癌診療指南(NCNN)。

1.2 NEDD9檢測(cè)方法

采用免疫組織化學(xué)方法。結(jié)直腸癌組織及正常組織標(biāo)本4 μm連續(xù)切片，石蠟切片常規(guī)脫蠟、水化，PBS清洗后用pH值為6的檸檬酸修復(fù)液在高壓鍋中進(jìn)行抗原修復(fù)，再次PBS清洗后用體積分?jǐn)?shù)0.03的H2O2室溫下孵育10 min，以消除內(nèi)源性過(guò)氧化物酶的活性，PBS清洗后用體積分?jǐn)?shù)0.10正常山羊血清(PBS稀釋)封閉，室溫孵育10 min，傾去 血清，勿洗。滴加一抗工作液，4 ℃過(guò)夜。第2天滴加二抗，室溫下孵育15 min，PBS清洗后進(jìn)行DAB染色，自來(lái)水充分沖洗終止染色，然后行復(fù)染、脫水、透明、封片。以PBS代替一抗作為陰性對(duì)照。

1.3 結(jié)果判定

每張切片均由兩名病理醫(yī)師雙盲閱片。在40倍顯微鏡下，計(jì)數(shù)10個(gè)視野陽(yáng)性細(xì)胞所占比例及視野綜合染色強(qiáng)度，并進(jìn)行評(píng)分。陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)評(píng)分：0分，陽(yáng)性細(xì)胞所占比例<10%；1分，陽(yáng)性細(xì)胞所占比例10%～25%；2分，陽(yáng)性細(xì)胞所占比例26%～50%；3分，陽(yáng)性細(xì)胞所占比例>50%。細(xì)胞染色強(qiáng)度評(píng)分：0分，無(wú)色；1分，染色淡黃色；2分，染色黃色；3分，染色棕黃色。根據(jù)染色強(qiáng)度評(píng)分與陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)評(píng)分的乘積計(jì)算最終得分，0～3分為NEDD9低表達(dá)，4～9分為NEDD9高表達(dá)。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

應(yīng)用SPSS 17.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，計(jì)數(shù)資料比較采用χ2檢驗(yàn)，生存分析采用Cox單因素及多因素分析，生存曲線(xiàn)應(yīng)用Kaplan-Meier方法。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 NEDD9在結(jié)直腸癌組織中的表達(dá)

NEDD9陽(yáng)性表達(dá)主要位于細(xì)胞質(zhì)，在結(jié)直腸癌組織中有68例高表達(dá)，在癌旁正常組織中有12例高表達(dá)，結(jié)直腸癌組織與癌旁正常組織NEDD9表達(dá)比較，差異有顯著性(χ2=65.35，P<0.01)。

2.2 結(jié)直腸癌組織NEDD9表達(dá)與臨床病理特征的關(guān)系

結(jié)直腸癌組織NEDD9表達(dá)與腫瘤TNM分期以及其中的pT、pN、pM有關(guān)(χ2=3.960～11.476，P<0.05)，與年齡、性別、部位及病理類(lèi)型無(wú)關(guān)(P>0.05)。見(jiàn)表1。

2.3 結(jié)直腸癌病人NEDD9表達(dá)與預(yù)后的相關(guān)性

Kaplan-Meier生存分析顯示，NEDD9低表達(dá)和高表達(dá)結(jié)直腸癌病人的5年生存率分別是62.5%和35.3%，Log Rank檢驗(yàn)顯示兩組病人生存曲線(xiàn)差異有顯著性(χ2=7.162，P<0.01)。見(jiàn)圖1。Cox單因素和多因素分析顯示，NEDD9表達(dá)和TNM分期是判斷結(jié)直腸癌病人預(yù)后的獨(dú)立因素。見(jiàn)表2。

3 討 論

盡管外科手術(shù)及放化療技術(shù)逐步發(fā)展，但局部復(fù)發(fā)及遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移仍然是結(jié)直腸癌病人死亡的主要因素。CEA、CA199和CA125已廣泛應(yīng)用于結(jié)直腸癌病人隨訪(fǎng)，但仍不能準(zhǔn)確預(yù)測(cè)復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移[9]。因此，急需新的標(biāo)記物監(jiān)測(cè)結(jié)直腸癌病人療效及判斷預(yù)后。本文的研究結(jié)果顯示，NEDD9在結(jié)直腸癌組織中的表達(dá)顯著高于癌旁正常組織，差異有顯著意義；NEDD9高表達(dá)與腫瘤的進(jìn)展密切相關(guān)，隨著腫瘤TNM分期的增加，NEDD9的表達(dá)增加；生存分析結(jié)果顯示，NEDD9高表達(dá)的結(jié)直腸癌病人與低表達(dá)的病人相比5年生存率更低；多因素分析結(jié)果顯示，NEDD9可以作為判斷結(jié)直腸癌預(yù)后的獨(dú)立因素。本文的研究結(jié)果與文獻(xiàn)報(bào)道相似[1-4]。說(shuō)明NEDD9表達(dá)與結(jié)直腸癌的進(jìn)展和預(yù)后密切相關(guān)， NEDD9高表達(dá)的結(jié)直腸癌病人更容易出現(xiàn)腫瘤進(jìn)展與轉(zhuǎn)移，進(jìn)而導(dǎo)致較差的預(yù)后。

表1結(jié)直腸癌病人NEDD9表達(dá)與臨床病理特征的相關(guān)性(例)

臨床病理參數(shù)nNEDD9高表達(dá)χ2值P值年齡(歲) <603828 ≥6054400.0020.967性別 男5239 女40290.0730.787病理類(lèi)型 管狀腺癌7757 黏液腺癌129 乳頭狀腺癌320.0900.956部位 乙狀結(jié)腸和直腸5741 右半結(jié)腸2620 左半結(jié)腸970.3080.857TNM分期 Ⅰ157 Ⅱ3021 Ⅲ3730 Ⅳ101010.6300.014pT T184 T2157 T33225 T4373211.4760.009pN N04528 N12823 N219188.6280.013pM M08258 M110103.9600.047

圖1 結(jié)直腸癌病人NEDD9高表達(dá)與低表達(dá)者5年生存曲線(xiàn)比較

表2結(jié)直腸癌病人5年生存率單因素和多因素Cox比例風(fēng)險(xiǎn)分析

影響因素單因素RR95%CIP值多因素RR95%CIP值年齡1.0030.968～1.0210.838性別1.3220.974～1.0330.326病理類(lèi)型1.4350.590～3.4900.980部位0.7300.387～1.3760.330TNM分期1.5041.033～1.3760.0441.4721.018～2.1300.040NEDD9表達(dá)2.1911.020～4.7080.0332.4351.120～5.2950.025

NEDD9最早發(fā)現(xiàn)在小鼠早期胚胎的大腦組織中表達(dá)，現(xiàn)研究證實(shí)其存在于所有的脊椎動(dòng)物中。在人正常組織中，NEDD9的mRNA及蛋白產(chǎn)物主要集中在肺、腎、含有大量未成熟淋巴樣細(xì)胞組織及胚胎期大腦組織(成人大腦含量降低)。已有研究結(jié)果顯示，NEDD9參與成膠質(zhì)細(xì)胞瘤、黑色素瘤、乳癌的轉(zhuǎn)移過(guò)程，認(rèn)為NEDD9與腫瘤細(xì)胞的侵襲、遷移、轉(zhuǎn)移有關(guān)。SIMA等[6]研究結(jié)果顯示，骨架蛋白NEDD9在宮頸癌組織中高表達(dá)，高表達(dá)的NEDD9 能夠促進(jìn)宮頸癌細(xì)胞的遷移與侵襲，這可能是通過(guò)黏著斑激酶(FAK)與酪氨酸激酶(SRC)的磷酸化及EMT作用實(shí)現(xiàn)的。KIM等[4]研究顯示，NEDD9表達(dá)與黑色素瘤的轉(zhuǎn)移有密切關(guān)系，在體內(nèi)、體外試驗(yàn)中都能夠增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞的侵襲性；轉(zhuǎn)移的黑色素瘤與原發(fā)黑色素瘤相比較，NEDD9有更高的表達(dá)強(qiáng)度。KONG等[2]研究顯示，NEDD9在進(jìn)展期乳癌組織中高表達(dá)，NEDD9通過(guò)上調(diào)EMT促進(jìn)腫瘤的侵襲與轉(zhuǎn)移。

腫瘤的增殖、侵襲與轉(zhuǎn)移是一個(gè)復(fù)雜連續(xù)的過(guò)程。NEDD9在其中的作用機(jī)制仍然不清楚?？赡苁荈AK與SRC磷酸化及EMT共同作用的結(jié)果。目前，多個(gè)研究小組一致認(rèn)為，細(xì)胞的黏附作用能夠引發(fā)SRC、NEDD9和FAK的相互作用，三者中任何一種蛋白的高表達(dá)或異常激活都能夠促進(jìn)FAK-CRK-SRC復(fù)合物的形成，它們的相互作用提高了SRC和FAK的活化作用，促進(jìn)NEDD9廣泛的磷酸化，進(jìn)而在SH2結(jié)構(gòu)域中為效應(yīng)蛋白創(chuàng)造結(jié)合位點(diǎn)。SIMA等[6]研究結(jié)果顯示，NEDD9的磷酸化與 FAK或SRC可能存在正反饋循環(huán)。腫瘤的侵襲通常需要EMT，細(xì)胞失去相互附著的能力，更加具有活動(dòng)性。張紅梅等[10]研究結(jié)果顯示，EMT的發(fā)生率與胰腺癌的轉(zhuǎn)移有密切聯(lián)系，EMT在胰腺癌的分化、浸潤(rùn)和轉(zhuǎn)移中起到重要作用。EMT能下調(diào)細(xì)胞之間起黏附作用的E-鈣黏蛋白，導(dǎo)致細(xì)胞黏著連接不穩(wěn)定。TIKHMYANOVA 等[3]的研究結(jié)果顯示，NEDD9是通過(guò)SRC將E-鈣黏蛋白從細(xì)胞膜表面移除并被溶酶體溶解。

綜上所述，NEDD9參與了結(jié)直腸癌的進(jìn)展與轉(zhuǎn)移，并能夠準(zhǔn)確判斷預(yù)后；NEDD9可作為判斷預(yù)后的標(biāo)記物并可為結(jié)直腸癌病人提供一個(gè)新的分子治療靶點(diǎn)。

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