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        介入化療前后宮頸癌組織pS53及pS642表達(dá)及意義

        2014-03-22 06:29:12,,
        精準(zhǔn)醫(yī)學(xué)雜志 2014年5期
        關(guān)鍵詞:細(xì)胞周期磷酸化栓塞

        ,,

        (1 青島大學(xué)附屬醫(yī)院婦科,山東 青島 266003; 2 青島市市北區(qū)人民醫(yī)院檢驗(yàn)科)

        宮頸癌是常見的婦科惡性腫瘤之一,主要治療方法是手術(shù)、放療及化療。化療主要用于中晚期病人,近年來術(shù)前新輔助化療(動(dòng)脈栓塞化療)廣泛應(yīng)用于臨床,提高了手術(shù)切除率,改善了預(yù)后。細(xì)胞有絲分裂抑制酶Wee1是細(xì)胞周期調(diào)控的一種關(guān)鍵激酶,與腫瘤的發(fā)生相關(guān)。Wee1第53及642位點(diǎn)絲氨酸磷酸化蛋白(pS53、pS642)在Wee1的失活與激活過程中起重要作用。本實(shí)驗(yàn)采用免疫組織化學(xué)法檢測動(dòng)脈栓塞化療前后宮頸癌組織中pS53及pS642的表達(dá),研究兩種蛋白的表達(dá)變化及其與臨床治療效果的相關(guān)性,并探討動(dòng)脈栓塞化療對細(xì)胞周期調(diào)控的影響,以期為判定動(dòng)脈栓塞化療的療效 提供客觀的依據(jù)?,F(xiàn)將結(jié)果報(bào)告如下。

        1 材料與方法

        1.1 材料來源

        所有標(biāo)本均取自2009年6月—2012年10月我院活檢或手術(shù)切除的宮頸組織蠟塊。其中宮頸癌病人50例,正常宮頸病人40例。病理檢查前未進(jìn)行放射等治療。宮頸癌病人年齡36~68歲,中位年齡45.3歲。所取得標(biāo)本均經(jīng)病理檢查確診為宮頸癌,且均為鱗癌。病人經(jīng)動(dòng)脈栓塞化療2~3周后行廣泛性子宮切除加盆腔淋巴結(jié)清掃術(shù),按2009年國際婦產(chǎn)科聯(lián)盟(FIGO)分期:ⅠB期25例,ⅡA期15例,ⅡB期10例。按組織分化程度分類:高分化15例,中分化30例,低分化5例。正常宮頸病人年 齡40~65歲,中位年齡46.4歲。標(biāo)本來源于宮頸活檢及子宮肌瘤、子宮腺肌病等子宮良性病變行子宮切除的宮頸組織。兩組病人年齡比較差異無顯著性(P>0.05)。

        1.2 試劑

        兔抗人pS53蛋白多克隆抗體、兔抗人pS642蛋白單克隆抗體、即用型快捷免疫組織化學(xué)MaxvisionTM2試劑盒(鼠-兔)二抗及液體DAB酶底物顯色試劑盒購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司。

        1.3 免疫組化方法檢測

        將蠟塊置于石蠟切片機(jī),連續(xù)4 μm厚切片,制成標(biāo)本后進(jìn)行免疫組化染色。切片依次行脫蠟水化、抗原修復(fù)、一抗孵育、二抗孵育、DAB顯色、蘇木精復(fù)染、脫水及中性樹膠封片。

        1.4 結(jié)果判斷

        pS53蛋白主要定位于細(xì)胞核中,偶爾在細(xì)胞漿中有少量染色;pS642蛋白主要定位于細(xì)胞漿中,細(xì)胞核中亦可有少量染色。切片染色后,在高倍視野下,隨機(jī)選取5個(gè)視野計(jì)算陽性細(xì)胞率。其陽性結(jié)果判斷參照SINICROPE等[1]的半定量積分法。以陽性細(xì)胞率≤5%為1分,6%~25%為2分,26%~50%為3分,51%~75%為4分,>75%為5分;染色無色為0分,淺黃色為1分,棕黃色為2分。陽性細(xì)胞率評分與染色強(qiáng)度評分乘積≥3分為陽性。

        2 結(jié) 果

        2.1 正常宮頸組織、動(dòng)脈栓塞化療前后宮頸癌組織中pS53及pS642的表達(dá)

        正常宮頸組織中pS53及pS642陽性表達(dá)率分別為15%(6/40)、40%(16/40),動(dòng)脈栓塞化療前宮頸癌組織中兩者陽性表達(dá)率分別為84%(42/50)、92%(46/50),組間比較差異有顯著性(χ2=42.50、28.10,P<0.01)。動(dòng)脈栓塞化療后宮頸癌組織中pS53及pS642陽性表達(dá)率為44%(22/50)和52%(26/50),較動(dòng)脈栓塞化療前明顯下降,差異有顯著性(χ2=17.36、19.84,P<0.01)。不同臨床分期、組織分化程度動(dòng)脈栓塞化療前后宮頸癌組織pS53、pS642表達(dá)差異無顯著性(P>0.05)。見表1。

        2.2 動(dòng)脈栓塞化療前后宮頸癌組織中pS53及pS642表達(dá)變化與臨床療效的關(guān)系

        動(dòng)脈栓塞化療后pS53上升者3例,有效率為0;pS53無變化者25例,有效率為88%;pS53下降者22例,有效率為100%。pS642上升者2例,有效率為0;pS642無變化者15例,有效率為73.3%;pS642下降33例,有效率為100%。pS53及pS642在動(dòng)脈栓塞化療前后表達(dá)變化與臨床療效呈負(fù)相關(guān),差異有顯著性(r=-0.328、-0.456,P<0.01)。

        表1介入化療前后宮頸癌組織pS53、pS642表達(dá)與臨床病理特征關(guān)系(例)

        臨床病理特征npS53化療前化療后pS642化療前化療后臨床分期5042224626 ⅠB期2520122215 ⅡA期15137147 ⅡB期1093104組織分化 高分化15117128 中分化3026132916 低分化55252

        3 討 論

        3.1 Wee1的表達(dá)及意義

        Wee1蛋白激酶是絲氨酸-蘇氨酸蛋白激酶家族的一員[2]。Cdc2作為細(xì)胞進(jìn)入有絲分裂的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子,其第15位上的酪氨酸可被Wee1磷酸化,而使Cdc2-CyclinB復(fù)合物失活[3],使細(xì)胞停滯在細(xì)胞間期進(jìn)行檢測和修復(fù)。隨后,細(xì)胞進(jìn)入G2/M期,Wee1降解,細(xì)胞通過G2/M期的檢測點(diǎn),完成增殖。在細(xì)胞增殖的過程中,如果Wee1表達(dá)出現(xiàn)異常,細(xì)胞或于間期停滯而凋亡,或變異后通過G2/M期檢測而發(fā)生癌變。Wee1一方面可通過磷酸化Cdc2阻止異常有絲分裂發(fā)生,另一方面其自身的某些位點(diǎn)也可發(fā)生磷酸化,調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖過程。例如Wee1的絲氨酸第642位點(diǎn)(Ser642)發(fā)生磷酸化后與14-3-3蛋白結(jié)合,能促使Wee1活化,維持Cdc2-CyclinB復(fù)合物失活,使細(xì)胞在間期進(jìn)行檢測和修復(fù)。KATAYAMAK等[4]通過實(shí)驗(yàn)證明,將Ser642位點(diǎn)的絲氨酸突變?yōu)楸彼岷?,Wee1的Ser642位點(diǎn)不能被磷酸化,而14-3-3蛋白主要通過磷酸化依賴的方式與靶蛋白結(jié)合來發(fā)揮調(diào)控作用,Wee1失去與14-3-3蛋白結(jié)合的能力,從而使Wee1失活,細(xì)胞增殖發(fā)生異常。這說明與14-3-3蛋白的結(jié)合需要Wee1 Ser642位點(diǎn)磷酸化,進(jìn)而說明Wee1的磷酸化活性調(diào)節(jié)位點(diǎn)位于Ser642。

        Wee1蛋白激酶在M期的降解是泛素依賴的降解,它的泛素化連接酶是β-TrCP-containing SCF復(fù)合物。Wee1的Ser53能夠與β-TrCP復(fù)合物特異性結(jié)合并發(fā)生磷酸化,從而使Wee1發(fā)生降解[5]。Wee1的降解在Cdc2激活中起重要作用[6],而Cdc2

        的激活是恢復(fù)因檢查修復(fù)DNA損傷點(diǎn)而停止的細(xì)胞周期所必需的。因此,Wee1的Ser53位點(diǎn)磷酸化對于細(xì)胞增殖順利進(jìn)行起重要作用。

        3.2 pS53及pS642的表達(dá)在宮頸癌動(dòng)脈栓塞化療中的意義

        本研究通過免疫組化染色方法檢測顯示,pS53及pS642兩種蛋白均在宮頸癌組織中高表達(dá),在正常宮頸組織中低表達(dá),而且其表達(dá)的變化與動(dòng)脈栓塞化療的效果呈負(fù)相關(guān)。Wee1調(diào)控細(xì)胞通過G2/M期檢測點(diǎn)。當(dāng)DNA復(fù)制異常時(shí),Wee1可以阻止有絲分裂繼續(xù)進(jìn)行,DNA完全修復(fù)后重新啟動(dòng)有絲分裂,以保持DNA的完整性。pS53及pS642在Wee1的活化與降解中起巨大作用。順鉑屬細(xì)胞周期非特異性細(xì)胞毒性藥物,在細(xì)胞內(nèi)可迅速解離,以水合陽離子的形式與細(xì)胞內(nèi)DNA結(jié)合形成鏈間、鏈內(nèi)或蛋白質(zhì)DNA交鏈,從而破壞DNA的結(jié)構(gòu)和功能。博來霉素抑制胸腺嘧啶核苷嵌入DNA,引起DNA單鏈和雙鏈斷裂,作用于增殖細(xì)胞周期的S期。在動(dòng)脈栓塞化療后pS53及pS642的表達(dá)明顯受到抑制,從而推測其與在細(xì)胞周期中化療藥物引起DNA的破壞、影響Wee1的穩(wěn)定性有關(guān)。Wee1降解異常,從而細(xì)胞越過DNA復(fù)制檢測點(diǎn)進(jìn)入有絲分裂期,進(jìn)行異常增殖。

        有研究顯示,在某些癌組織中Wee1的表達(dá)高于其在正常組織中的表達(dá)[7]。本研究結(jié)果提示,動(dòng)脈栓塞化療的有效性和pS53、pS642的表達(dá)相關(guān),但Wee1和pS53、pS642在動(dòng)脈栓塞化療過程中的具體作用機(jī)制尚需要進(jìn)一步研究。目前對于細(xì)胞增殖的研究表明,Wee1抑制劑能抑制宮頸癌細(xì)胞株HeLa細(xì)胞的增殖,因此,我們可利用其在細(xì)胞周期中G1期的缺陷[8],運(yùn)用siRNA轉(zhuǎn)染法將Wee1抑制劑作用于腫瘤細(xì)胞,可抑制腫瘤細(xì)胞的生長和增殖。因此,Wee1抑制劑可作為抗腫瘤的分子藥物。研究顯示,Wee1抑制劑還可協(xié)同其他抗腫瘤藥物共同發(fā)揮作用。例如通過siRNA轉(zhuǎn)染法將Wee1抑制劑作用于腫瘤細(xì)胞后,Wee1失活,這時(shí)腫瘤細(xì)胞更容易被其他化療藥物,例如多柔比星殺死,同時(shí)正常細(xì)胞損傷不明顯。Wee1抑制劑(如MK-1775)亦可單一或與吉西他濱、卡鉑、順鉑等化療藥物合用治療進(jìn)展期的實(shí)體腫瘤。因此,我們可以期待在不久的將來,臨床上與Wee1及pS53、pS642相關(guān)藥物的廣泛應(yīng)用能夠?yàn)閷m頸癌病人的治療提供更多、更好的手段。

        [參考文獻(xiàn)]

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