，，

(1 青島大學(xué)附屬醫(yī)院婦科，山東 青島 266003； 2 青島市市北區(qū)人民醫(yī)院檢驗(yàn)科)

宮頸癌是常見的婦科惡性腫瘤之一，主要治療方法是手術(shù)、放療及化療。化療主要用于中晚期病人，近年來術(shù)前新輔助化療(動(dòng)脈栓塞化療)廣泛應(yīng)用于臨床，提高了手術(shù)切除率，改善了預(yù)后。細(xì)胞有絲分裂抑制酶Wee1是細(xì)胞周期調(diào)控的一種關(guān)鍵激酶，與腫瘤的發(fā)生相關(guān)。Wee1第53及642位點(diǎn)絲氨酸磷酸化蛋白(pS53、pS642)在Wee1的失活與激活過程中起重要作用。本實(shí)驗(yàn)采用免疫組織化學(xué)法檢測動(dòng)脈栓塞化療前后宮頸癌組織中pS53及pS642的表達(dá)，研究兩種蛋白的表達(dá)變化及其與臨床治療效果的相關(guān)性，并探討動(dòng)脈栓塞化療對細(xì)胞周期調(diào)控的影響，以期為判定動(dòng)脈栓塞化療的療效 提供客觀的依據(jù)?，F(xiàn)將結(jié)果報(bào)告如下。

1 材料與方法

1.1 材料來源

所有標(biāo)本均取自2009年6月—2012年10月我院活檢或手術(shù)切除的宮頸組織蠟塊。其中宮頸癌病人50例，正常宮頸病人40例。病理檢查前未進(jìn)行放射等治療。宮頸癌病人年齡36～68歲，中位年齡45.3歲。所取得標(biāo)本均經(jīng)病理檢查確診為宮頸癌，且均為鱗癌。病人經(jīng)動(dòng)脈栓塞化療2～3周后行廣泛性子宮切除加盆腔淋巴結(jié)清掃術(shù)，按2009年國際婦產(chǎn)科聯(lián)盟(FIGO)分期：ⅠB期25例，ⅡA期15例，ⅡB期10例。按組織分化程度分類：高分化15例，中分化30例，低分化5例。正常宮頸病人年 齡40～65歲，中位年齡46.4歲。標(biāo)本來源于宮頸活檢及子宮肌瘤、子宮腺肌病等子宮良性病變行子宮切除的宮頸組織。兩組病人年齡比較差異無顯著性(P>0.05)。

1.2 試劑

兔抗人pS53蛋白多克隆抗體、兔抗人pS642蛋白單克隆抗體、即用型快捷免疫組織化學(xué)MaxvisionTM2試劑盒(鼠-兔)二抗及液體DAB酶底物顯色試劑盒購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司。

1.3 免疫組化方法檢測

將蠟塊置于石蠟切片機(jī)，連續(xù)4 μm厚切片，制成標(biāo)本后進(jìn)行免疫組化染色。切片依次行脫蠟水化、抗原修復(fù)、一抗孵育、二抗孵育、DAB顯色、蘇木精復(fù)染、脫水及中性樹膠封片。

1.4 結(jié)果判斷

pS53蛋白主要定位于細(xì)胞核中，偶爾在細(xì)胞漿中有少量染色；pS642蛋白主要定位于細(xì)胞漿中，細(xì)胞核中亦可有少量染色。切片染色后，在高倍視野下，隨機(jī)選取5個(gè)視野計(jì)算陽性細(xì)胞率。其陽性結(jié)果判斷參照SINICROPE等[1]的半定量積分法。以陽性細(xì)胞率≤5%為1分，6%～25%為2分，26%～50%為3分，51%～75%為4分，>75%為5分；染色無色為0分，淺黃色為1分，棕黃色為2分。陽性細(xì)胞率評分與染色強(qiáng)度評分乘積≥3分為陽性。

2 結(jié) 果

2.1 正常宮頸組織、動(dòng)脈栓塞化療前后宮頸癌組織中pS53及pS642的表達(dá)

正常宮頸組織中pS53及pS642陽性表達(dá)率分別為15%(6/40)、40%(16/40)，動(dòng)脈栓塞化療前宮頸癌組織中兩者陽性表達(dá)率分別為84%(42/50)、92%(46/50)，組間比較差異有顯著性(χ2=42.50、28.10，P<0.01)。動(dòng)脈栓塞化療后宮頸癌組織中pS53及pS642陽性表達(dá)率為44%(22/50)和52%(26/50)，較動(dòng)脈栓塞化療前明顯下降，差異有顯著性(χ2=17.36、19.84，P<0.01)。不同臨床分期、組織分化程度動(dòng)脈栓塞化療前后宮頸癌組織pS53、pS642表達(dá)差異無顯著性(P>0.05)。見表1。

2.2 動(dòng)脈栓塞化療前后宮頸癌組織中pS53及pS642表達(dá)變化與臨床療效的關(guān)系

動(dòng)脈栓塞化療后pS53上升者3例，有效率為0；pS53無變化者25例，有效率為88%；pS53下降者22例，有效率為100%。pS642上升者2例，有效率為0；pS642無變化者15例，有效率為73.3%；pS642下降33例，有效率為100%。pS53及pS642在動(dòng)脈栓塞化療前后表達(dá)變化與臨床療效呈負(fù)相關(guān)，差異有顯著性(r=-0.328、-0.456，P<0.01)。

表1介入化療前后宮頸癌組織pS53、pS642表達(dá)與臨床病理特征關(guān)系(例)

臨床病理特征npS53化療前化療后pS642化療前化療后臨床分期5042224626 ⅠB期2520122215 ⅡA期15137147 ⅡB期1093104組織分化 高分化15117128 中分化3026132916 低分化55252

3 討 論

3.1 Wee1的表達(dá)及意義

Wee1蛋白激酶是絲氨酸-蘇氨酸蛋白激酶家族的一員[2]。Cdc2作為細(xì)胞進(jìn)入有絲分裂的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子，其第15位上的酪氨酸可被Wee1磷酸化，而使Cdc2-CyclinB復(fù)合物失活[3]，使細(xì)胞停滯在細(xì)胞間期進(jìn)行檢測和修復(fù)。隨后，細(xì)胞進(jìn)入G2/M期，Wee1降解，細(xì)胞通過G2/M期的檢測點(diǎn)，完成增殖。在細(xì)胞增殖的過程中，如果Wee1表達(dá)出現(xiàn)異常，細(xì)胞或于間期停滯而凋亡，或變異后通過G2/M期檢測而發(fā)生癌變。Wee1一方面可通過磷酸化Cdc2阻止異常有絲分裂發(fā)生，另一方面其自身的某些位點(diǎn)也可發(fā)生磷酸化，調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖過程。例如Wee1的絲氨酸第642位點(diǎn)(Ser642)發(fā)生磷酸化后與14-3-3蛋白結(jié)合，能促使Wee1活化，維持Cdc2-CyclinB復(fù)合物失活，使細(xì)胞在間期進(jìn)行檢測和修復(fù)。KATAYAMAK等[4]通過實(shí)驗(yàn)證明，將Ser642位點(diǎn)的絲氨酸突變?yōu)楸彼岷?，Wee1的Ser642位點(diǎn)不能被磷酸化，而14-3-3蛋白主要通過磷酸化依賴的方式與靶蛋白結(jié)合來發(fā)揮調(diào)控作用，Wee1失去與14-3-3蛋白結(jié)合的能力，從而使Wee1失活，細(xì)胞增殖發(fā)生異常。這說明與14-3-3蛋白的結(jié)合需要Wee1 Ser642位點(diǎn)磷酸化，進(jìn)而說明Wee1的磷酸化活性調(diào)節(jié)位點(diǎn)位于Ser642。

Wee1蛋白激酶在M期的降解是泛素依賴的降解，它的泛素化連接酶是β-TrCP-containing SCF復(fù)合物。Wee1的Ser53能夠與β-TrCP復(fù)合物特異性結(jié)合并發(fā)生磷酸化，從而使Wee1發(fā)生降解[5]。Wee1的降解在Cdc2激活中起重要作用[6]，而Cdc2

的激活是恢復(fù)因檢查修復(fù)DNA損傷點(diǎn)而停止的細(xì)胞周期所必需的。因此，Wee1的Ser53位點(diǎn)磷酸化對于細(xì)胞增殖順利進(jìn)行起重要作用。

3.2 pS53及pS642的表達(dá)在宮頸癌動(dòng)脈栓塞化療中的意義

本研究通過免疫組化染色方法檢測顯示，pS53及pS642兩種蛋白均在宮頸癌組織中高表達(dá)，在正常宮頸組織中低表達(dá)，而且其表達(dá)的變化與動(dòng)脈栓塞化療的效果呈負(fù)相關(guān)。Wee1調(diào)控細(xì)胞通過G2/M期檢測點(diǎn)。當(dāng)DNA復(fù)制異常時(shí)，Wee1可以阻止有絲分裂繼續(xù)進(jìn)行，DNA完全修復(fù)后重新啟動(dòng)有絲分裂，以保持DNA的完整性。pS53及pS642在Wee1的活化與降解中起巨大作用。順鉑屬細(xì)胞周期非特異性細(xì)胞毒性藥物，在細(xì)胞內(nèi)可迅速解離，以水合陽離子的形式與細(xì)胞內(nèi)DNA結(jié)合形成鏈間、鏈內(nèi)或蛋白質(zhì)DNA交鏈，從而破壞DNA的結(jié)構(gòu)和功能。博來霉素抑制胸腺嘧啶核苷嵌入DNA，引起DNA單鏈和雙鏈斷裂，作用于增殖細(xì)胞周期的S期。在動(dòng)脈栓塞化療后pS53及pS642的表達(dá)明顯受到抑制，從而推測其與在細(xì)胞周期中化療藥物引起DNA的破壞、影響Wee1的穩(wěn)定性有關(guān)。Wee1降解異常，從而細(xì)胞越過DNA復(fù)制檢測點(diǎn)進(jìn)入有絲分裂期，進(jìn)行異常增殖。

有研究顯示，在某些癌組織中Wee1的表達(dá)高于其在正常組織中的表達(dá)[7]。本研究結(jié)果提示，動(dòng)脈栓塞化療的有效性和pS53、pS642的表達(dá)相關(guān)，但Wee1和pS53、pS642在動(dòng)脈栓塞化療過程中的具體作用機(jī)制尚需要進(jìn)一步研究。目前對于細(xì)胞增殖的研究表明，Wee1抑制劑能抑制宮頸癌細(xì)胞株HeLa細(xì)胞的增殖，因此，我們可利用其在細(xì)胞周期中G1期的缺陷[8]，運(yùn)用siRNA轉(zhuǎn)染法將Wee1抑制劑作用于腫瘤細(xì)胞，可抑制腫瘤細(xì)胞的生長和增殖。因此，Wee1抑制劑可作為抗腫瘤的分子藥物。研究顯示，Wee1抑制劑還可協(xié)同其他抗腫瘤藥物共同發(fā)揮作用。例如通過siRNA轉(zhuǎn)染法將Wee1抑制劑作用于腫瘤細(xì)胞后，Wee1失活，這時(shí)腫瘤細(xì)胞更容易被其他化療藥物，例如多柔比星殺死，同時(shí)正常細(xì)胞損傷不明顯。Wee1抑制劑(如MK-1775)亦可單一或與吉西他濱、卡鉑、順鉑等化療藥物合用治療進(jìn)展期的實(shí)體腫瘤。因此，我們可以期待在不久的將來，臨床上與Wee1及pS53、pS642相關(guān)藥物的廣泛應(yīng)用能夠?yàn)閷m頸癌病人的治療提供更多、更好的手段。

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