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(青島大學(xué)醫(yī)學(xué)院,山東 青島 266003 1 附屬醫(yī)院乳腺外科； 2 生物化學(xué)與分子生物學(xué)教研室)

乳癌是女性最常見的惡性腫瘤之一，我國乳癌的發(fā)病率在近20年呈逐漸上升趨勢，尤其在京、津、滬等大城市，乳癌已位居女性惡性腫瘤發(fā)病率之首，嚴(yán)重危害女性健康[1]。micro RNAs(miRNAs)是一類由22個氨基酸組成、高度保守的單鏈非編碼RNA， 廣泛存在于真核細(xì)胞生物中，具有轉(zhuǎn)錄后基因調(diào)控功能。成熟的miRNAs通過堿基互補(bǔ)配對的方式與靶mRNA的編碼序列(CDS)或3′-非翻譯區(qū)(3′-UTR)結(jié)合，引起靶mRNA 的翻譯抑制或切割降解。miRNAs 具有多種生物學(xué)功能，在細(xì)胞發(fā)育、分化、增殖、凋亡過程發(fā)揮調(diào)控作用[2-4]。研究顯示, miRNA 10b(miR-10b)、miRNA 195(miR-195)在多種腫瘤細(xì)胞中表達(dá)均下調(diào)，與腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。本文通過研究miR-10b、miR-195在乳 癌組織中的表達(dá)及其與乳癌臨床病理特征之間的關(guān)系，探討miR-10b、miR-195在乳癌發(fā)生、發(fā)展中的作用?，F(xiàn)將結(jié)果報告如下。

1 資料與方法

1.1 標(biāo)本及其來源

乳癌及癌旁組織(距腫瘤邊緣≥5 cm)標(biāo)本40例，取自我院2013年1—6月期間手術(shù)病人，均為女性，年齡28～77歲，中位年齡49.6歲。經(jīng)術(shù)后病理檢查診斷為浸潤性導(dǎo)管癌。所有病人術(shù)前未接受放療、化療及內(nèi)分泌治療。

1.2 實驗試劑及引物

RNAiso Plus(Total RNA提取試劑)及SYBR熒光定量試劑盒(SYBR?Premix Ex TaqTMⅡ)均由寶生物工程(大連)有限公司提供，逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(BioRT Two Step RT-PCR Kit)購自博日科技有限公司。引物根據(jù)miRBASE數(shù)據(jù)庫設(shè)計，以U6作為內(nèi)參，引物由上海桑尼生物科技有限公司合成，引物序列見表1。

表1 各引物序列

注：a通用正向引物，b莖環(huán)引物，c正向引物，d反向引物。

1.3 檢測指標(biāo)及方法

1.3.1TRIzol法提取總RNA 按Total RNA 提取試劑所示步驟提取組織中的總RNA，用紫外線分光光度計檢測總RNA濃度及其波長在260 nm和280 nm處吸光度(A)值，所得A260/280值均在1.8～2.0之間。

1.3.2miR-10b、miR-195表達(dá)檢測 采用實時熒光RT-PCR 方法。參照SYBR?Premix Ex TaqTMⅡ及BioRT Two Step RT-PCR Kit說明書進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄及PCR反應(yīng)，反應(yīng)體系均為10 μL。逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)條件為：55 ℃ 45 min，95 ℃ 5 min，4 ℃ 5 min；PCR反應(yīng)條件為：94 ℃預(yù)變性10 min，94 ℃變性30 s，60 ℃退火30 s， 72 ℃延伸30 s，30個循環(huán)。以U6為內(nèi)參基因,對目的基因進(jìn)行均一化處理,根據(jù)熒光閾值(CT值)計算miR-10b、miR-195相對表達(dá)量，計算公式為2-△△CT。其中△CT=CT目標(biāo)miRNA-CTU6，△△CT=△CT癌組織-△CT癌旁組織。

1.4 統(tǒng)計學(xué)處理

應(yīng)用SPSS 16.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)處理，數(shù)據(jù)間比較采用t檢驗，相關(guān)性分析采用Mann-Whitney U檢驗。

2 結(jié) 果

2.1 乳癌及癌旁組織miR-10b、miR-195表達(dá)比較

癌旁組織中miR-10b及miR-195的表達(dá)量為1.00,miR-10b、miR-195在乳癌組織中的相對表達(dá)量分別為0.35±0.40、0.44±0.46，乳癌組織與癌旁組織miR-10b、miR-195表達(dá)比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(t=4.35、5.71，P<0.05)。

2.2 乳癌組織miR-10b、miR-195表達(dá)與臨床病理特征之間的關(guān)系

腫瘤直徑>5 cm的乳癌組織中miR-195表達(dá)較直徑≤5 cm者低，有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及間質(zhì)脈管癌栓的乳癌組織中miR-195表達(dá)明顯低于無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、無間質(zhì)脈管癌栓的乳癌組織，差異均有顯著意義(U=-2.127～-2.083，P<0.05)；miR-10b表達(dá)與腫瘤大小、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及間質(zhì)脈管癌栓等均無相關(guān)性(P>0.05)。miR-10b、miR-195表達(dá)與腫瘤TNM分期、雌激素受體(ER)、孕激素受體(PR)及人表皮生長因子受體-2(Her-2)水平均無明顯相關(guān)性(P>0.05)。見表2。

表2 miR-10b、miR-195表達(dá)與乳癌臨床病理特征的關(guān)系

3 討 論

2002年，CALIN等[5]首次報道m(xù)iRNAs表達(dá)異常與腫瘤相關(guān)，之后，眾多研究小組在多種人類腫瘤組織中檢測到miRNA異常表達(dá)。這些異常表達(dá)的miRNAs作用類似于癌基因或抑癌基因，如miRNA155作為癌基因，在一些淋巴瘤亞型中過度表達(dá)；而miRNA143和miRNA145作為抑癌基因在結(jié)、直腸癌的表達(dá)水平下降[6]。與乳癌相關(guān)的miRNAs目前也有報道。IORIO等[7]通過對10例正常乳房組織和76例乳癌組織miRNAs的表達(dá)水平進(jìn)行比較，證實miR-125b、miR-145、miR-155和miR-21在乳癌中表達(dá)顯著下調(diào)，其中miR-155降低程度尤為明顯，miRNAs的表達(dá)水平與乳癌的病理生理學(xué)特征相關(guān)，如病理學(xué)分期、增殖指數(shù)、ER/PR表達(dá)[8]及血管受侵等。TAVAZOIE等[9]研究了一系列與乳癌轉(zhuǎn)移密切相關(guān)的miRNAs，其中miR-335、miR-206與miR-126對腫瘤轉(zhuǎn)移的抑制發(fā)揮著關(guān)鍵性作用。miR-195位于染色體17p13.1，屬于miR-15/16/195家族，該家族與腫瘤發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)。早期研究結(jié)果顯示，miR-195在肥大心肌細(xì)胞中過度表達(dá)，可致轉(zhuǎn)基因小鼠病理性心臟生長及心力衰竭。近期研究顯示，miR-195在多種腫瘤組織表達(dá)下調(diào)，包括胃癌[10]、肝癌[11]、膀胱癌[12]等。LI等[13]應(yīng)用miR-195轉(zhuǎn)染MCF7及ZR-75-30細(xì)胞系，結(jié)果顯示miR-195高表達(dá)可顯著抑制細(xì)胞集落形成，誘導(dǎo)細(xì)胞G1期阻滯。已有研究顯示，原癌基因絲氨酸-蘇氨酸蛋白激酶(Raf-1)亦是miR-195的作用靶點，引入miR-195則可以抑制Raf-1的表達(dá)[14]。Raf-1在MAPK/ERK信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中發(fā)揮作用，活化的Raf-1能夠調(diào)節(jié)細(xì)胞周期、細(xì)胞遷移、凋亡及分化。本實驗結(jié)果顯示，miR-195在乳癌組織中表達(dá)明顯下調(diào)，其表達(dá)水平與腫瘤大小、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及脈管癌栓侵犯有關(guān)，與腫瘤TNM分期、ER、PR及Her-2水平無明顯相關(guān)性。提高miR-195可能對腫瘤的生長、浸潤、轉(zhuǎn)移起抑制作用。

有研究顯示,miR-10b能夠促進(jìn)腫瘤細(xì)胞侵襲及轉(zhuǎn)移，其在轉(zhuǎn)移性乳癌中表達(dá)增高[15]。此外，非浸潤性乳癌組織中miR-10b表達(dá)上調(diào)可致腫瘤侵襲和轉(zhuǎn)移能力顯著增強(qiáng)。Twist是一種凋亡抑制蛋白，它可以與miR-10b啟動子區(qū)結(jié)合并誘導(dǎo)其表達(dá)，造成促轉(zhuǎn)移基因(RHOC)表達(dá)增加，從而引起腫瘤的侵襲及轉(zhuǎn)移[16]。本文研究結(jié)果顯示，miR-10b在癌組織中表達(dá)下調(diào)，其表達(dá)水平與腫瘤大小、有無脈管癌栓、TNM分期及ER、PR、Her-2水平等均無明顯相關(guān)性。說明miR-10b可能主要在腫瘤進(jìn)展晚期發(fā)生遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的階段發(fā)揮作用。

綜上所述，miR-10b及miR-195在乳癌組織中表達(dá)明顯下調(diào)，可能在乳癌發(fā)生、發(fā)展中發(fā)揮作用，可作為篩查和診斷乳腺腫瘤的潛在生物學(xué)指標(biāo)。

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