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(青島大學(xué)醫(yī)學(xué)院，山東 青島 266003 1 附屬醫(yī)院婦科； 2 微生物學(xué)教研室)

人轉(zhuǎn)錄激活因子5(ATF5)在卵巢癌組織中高表達，并特異性地促進腫瘤細胞存活，而抑制其功能，可誘導(dǎo)卵巢癌細胞凋亡[1]。本次實驗通過RNA干擾抑制ATF5的表達，形成ATF5功能缺失的腫瘤細胞，再將細胞接種至裸鼠皮下觀察成瘤情況，了解在細胞水平抑制ATF5功能后對卵巢癌生物學(xué) 行為的影響，初步探討將ATF5作為靶基因?qū)β殉舶┻M行基因治療的可能性。

1 材料和方法

1.1 材料來源

人卵巢癌細胞株SKOV-3購于中國科學(xué)院上海細胞庫。4～6周齡BALB/c/nu雌性裸鼠(體質(zhì)量為18～20 g)購于北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司，于青島大學(xué)病原生物學(xué)重點實驗室SPF條件下飼養(yǎng)。

1.2 儀器及試劑

McCoY′5A培養(yǎng)基、二甲基亞楓、四甲基偶氮唑藍(美國Sigma公司)；胎牛血清(美國Hyclone公司)；羅氏TUNEL細胞凋亡檢測試劑盒(美國Roche公司)；DNA Marker(日本Takara公司)；兔抗人ATF5多克隆抗體(英國Abcam公司)；小鼠抗人β-actin 單克隆抗體(武漢博士德生物工程有限公司)；HRP標記的山羊抗小鼠IgG及山羊抗兔IgG(北京博奧森生物技術(shù)有限公司)。

1.3 方法

1.3.1擴增引物設(shè)計 在基因序列數(shù)據(jù)庫中檢索ATF5、β-actin基因的mRNA序列，通過比對，并用Primer5軟件設(shè)計特異性擴增引物，交由上海生工生物工程有限公司合成。將合成的引物送交上海吉凱基因化學(xué)技術(shù)有限公司進行慢病毒包裝。

1.3.2細胞培養(yǎng) 將SKOV-3細胞培養(yǎng)于含有體積分數(shù)0.10胎牛血清的McCoY′5A培養(yǎng)液中，置于37 ℃、含體積分數(shù)0.05 CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.3.3細胞轉(zhuǎn)染 取對數(shù)生長期的細胞，接種于6孔板中，每孔2×106個細胞，分為空白對照組、空載體對照組和實驗組，待細胞融合到50%～70%時，空白對照組更換新鮮培養(yǎng)液2 mL；空載體對照組加入攜帶非特異性質(zhì)粒的病毒液100 μL，polybrene 100 μL(終濃度為5 mg/L)及新鮮培養(yǎng)液1.8 mL；實驗組加入攜帶特異性干擾質(zhì)粒的病毒液100 μL，polybrene 100 μL(終濃度為5 mg/L)及新鮮培養(yǎng)液1.8 mL；常規(guī)培養(yǎng)8 h后更換培養(yǎng)液,培養(yǎng)3～5 d觀察熒光。

1.3.4MTT法檢測體外細胞增殖狀態(tài) 細胞密度調(diào)至1×108/L,分別取空白對照組、空載體對照組、特異性轉(zhuǎn)染的實驗組細胞懸液100 μL接種于96孔板，每組細胞設(shè)4個復(fù)孔，常規(guī)培養(yǎng)1～5 d，每天觀察細胞生長狀態(tài)。培養(yǎng)結(jié)束前4 h，每孔加入MTT溶液(5 g/L，用PBS配制成pH 7.4)20 μL，繼續(xù)孵育4 h。終止培養(yǎng)，小心吸棄孔內(nèi)培養(yǎng)上清液，每孔加DMSO 150 μL，振蕩10 min，在酶聯(lián)免疫監(jiān)測儀上測定各孔在波長 490 nm處吸光度(A)值。

1.3.5TUNEL法檢測體外細胞凋亡狀態(tài) 將玻片高壓滅菌后放入24孔培養(yǎng)板中，調(diào)細胞密度至5×108/L,分別取3組細胞懸液500 μL,接種于24孔板中的蓋玻片上，待細胞融合達60%～80%時，利用羅氏TUNEL檢測試劑盒檢測細胞凋亡情況。

1.3.6荷瘤小鼠模型的建立及成瘤率觀察 將裸鼠隨機分為3組，空白對照組、空載體對照組及實驗組，每組5只小鼠。分別取對數(shù)生長期細胞5×106個，每只裸鼠右側(cè)腋下注射[2]。每天對比觀察裸鼠及腫瘤生長情況。接種后4周末脫頸處死，完整剝離腫瘤，稱取瘤質(zhì)量，并計算移植瘤體積[3]。

1.3.7荷瘤小鼠腫瘤組織形態(tài)學(xué)觀察 取出瘤組織觀察其表面形態(tài)；取部分瘤組織置40 g/L甲醛溶液中固定，常規(guī)石蠟包埋、切片后蘇木精-伊紅(HE)染色觀察；另一部分瘤組織于-80 ℃冰箱凍存，進行分子生物學(xué)指標的檢測。

1.3.8RT-PCR方法檢測ATF5 mRNA表達水平將-80 ℃凍存的腫瘤組織用Trizol試劑提取其總RNA，計算RNA濃度。取3 μg總RNA，進行逆轉(zhuǎn)錄，擴增產(chǎn)物于10 g/L的瓊脂糖凝膠中電泳，凝膠成像系統(tǒng)拍照，Quantity One軟件進行灰度分析。

1.3.9Western-Blot方法檢測腫瘤組織ATF5蛋白的表達 取-80 ℃凍存的腫瘤組織，液氮研磨，蛋白裂解液裂解，測定蛋白含量后進行SDS-PAGE電泳分離蛋白，轉(zhuǎn)膜，一抗、二抗孵育，化學(xué)發(fā)光，UVP凝膠成像系統(tǒng)拍照，以β-actin為內(nèi)參照,實驗重復(fù)3次，實驗結(jié)果取均值。

2 結(jié) 果

2.1 質(zhì)粒轉(zhuǎn)染SKOV-3細胞情況及轉(zhuǎn)染效率

慢病毒攜帶的質(zhì)粒均帶紅色熒光蛋白基因，轉(zhuǎn)染成功后在綠光激發(fā)下熒光顯微鏡觀察可見紅色熒光。根據(jù)不同復(fù)感染指數(shù) (MOI)，確定最佳MOI為1∶40。熒光顯微鏡下觀察顯示，質(zhì)粒轉(zhuǎn)染第3天開始出現(xiàn)熒光，轉(zhuǎn)染后第5天在同一視野下的熒光圖像及明視野圖像顯示，70%以上細胞出現(xiàn)熒光(圖1)，結(jié)果表明慢病毒攜帶的質(zhì)粒成功轉(zhuǎn)染卵巢癌SKOV-3細胞。

2.2 MTT法檢測各組細胞體外生長增殖情況

與實驗組比較，空白對照組和空載體對照組細胞均具典型形態(tài)，折光性、貼壁狀況良好；3組在相同培養(yǎng)時間SKOV-3細胞增殖情況比較差異無顯著性(P>0.05)。見表1。

2.3 各組細胞體外生長凋亡狀況

如圖2所示，實驗組凋亡細胞數(shù)量明顯多于空白對照組和空載體對照組，空白對照組和空載體對照組間細胞凋亡數(shù)量比較差異不明顯，說明靶向沉默ATF5可促進卵巢癌SKOV-3細胞的凋亡。

2.4 沉默ATF5對裸鼠體內(nèi)成瘤的影響

接種腫瘤細胞后第3天，空白對照組和空載體對照組皮下全部成瘤，實驗組較其他兩組成瘤時間晚。實驗4周末，實驗組、空白對照組和空載體對照組腫瘤體積分別為(970.85±49.30)、(2 500.66±97.97)、(2 475.87±91.03)mm3，實驗組腫瘤體積明顯小于對照組(F=2.21，P<0.05)，空白對照組和空載體對照組比較差異無顯著統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。實驗組、空白對照組和空載體對照組腫瘤質(zhì)量分別為(1.26±0.18)、(2.53±0.28)、(2.53±0.28)g，實驗組腫瘤質(zhì)量明顯小于對照組，差異有顯著性(F=4.01，P<0.05)，空白對照組和空載體對照組比較差異無顯著統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。

2.5 荷瘤小鼠腫瘤組織的形態(tài)學(xué)觀察

各組移植瘤無明顯周圍組織浸潤現(xiàn)象，易分離。HE染色顯示，空白對照組和空載體對照組鏡下瘤組織細胞密集，胞質(zhì)豐富，胞核大而深染，異型性明顯，核分裂象多見。實驗組瘤細胞數(shù)目相對稀少，胞核較小，胞質(zhì)少，核分裂象少見(圖3)。

A為實驗組熒光顯微鏡下紅色熒光蛋白表達情況；B為實驗組光鏡下細胞形態(tài)；C為空載體對照組熒光顯微鏡下紅色熒光蛋白表達情況；D為空載體對照組光鏡下細胞形態(tài)。

圖1質(zhì)粒轉(zhuǎn)染后細胞內(nèi)綠色熒光蛋白表達情況

A：空白對照組光學(xué)顯微鏡下細胞凋亡情況；B：空載體對照組光學(xué)顯微鏡下細胞凋亡情況；C：實驗組光學(xué)顯微鏡下細胞凋亡情況。100倍。

圖2羅氏TUNEL檢測試劑盒檢測細胞凋亡情況

A：空白對照組光學(xué)顯微鏡下細胞形態(tài)；B：空載體對照組光學(xué)顯微鏡下細胞形態(tài)；C：實驗組光學(xué)顯微鏡下細胞形態(tài)。HE染色，400倍。

圖3各組腫瘤組織的形態(tài)學(xué)變化

2.6 各組腫瘤組織中ATF5 mRNA的表達

空白對照組、空載體對照組與實驗組腫瘤組織ATF5 mRNA與內(nèi)參β-actin的比值分別為0.79±0.08、0.75±0.19、0.55±0.14，空白對照組比值最高，與空載體對照組相比差異無顯著性，與實驗組相比差異有顯著性(F=4.01，P<0.05)。Western-Blot方法檢測3種腫瘤組織中ATF5蛋白的表達，結(jié)果與RT-PCR結(jié)果一致。見圖4。

A為RT-PCR檢測3組移植瘤組織ATF5 mRNA表達：M為Marker；①～③為空白對照組、空載體對照組及實驗組移植瘤組織β-actin mRNA表達；④～⑥為移植瘤組織ATF5 mRNA表達；B為Western-Blot方法檢測3組移植瘤組織ATF5蛋白表達。

圖4各組腫瘤組織中ATF5mRNA的表達情況

3 討 論

卵巢癌是女性生殖器官常見的腫瘤之一，癌細胞擴散途徑廣泛，在婦科惡性腫瘤中其死亡率高居首位[4]，嚴重威脅女性的生命健康。RNA干擾可以特異性剔除或關(guān)閉特定基因的表達，而阻斷之后相應(yīng)的細胞就可表達出這種基因缺失的表型[5]。小干擾RNA(siRNA)是RNA干擾的效應(yīng)分子，體外合成siRNA則是RNA干擾技術(shù)的最新發(fā)展，尤其在特異性抑制哺乳動物細胞基因方面，為基因治療開創(chuàng)了新的途徑[6]。

ATF5是激活轉(zhuǎn)錄-cAMP家族成員之一，其C端含有堿性亮氨酸拉鏈特異性結(jié)構(gòu)域，在細胞凋亡、分化和發(fā)育等生理過程中發(fā)揮重要作用[7-8]，是一種與凋亡密切相關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子。已有研究結(jié)果顯示，在上皮性卵巢癌組織中ATF5高表達，其蛋白表達與卵巢癌臨床分期和組織分化程度有關(guān)，與腫瘤組織分型無明顯相關(guān)性，說明ATF5與卵巢癌發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)[1]。由此推測，將ATF5干擾基因?qū)肼殉舶┘毎?，可能對提高機體抗瘤效應(yīng)有一定的應(yīng)用價值。

本文的研究結(jié)果顯示，攜帶特異性ATF5干擾基因的質(zhì)?？沙晒D(zhuǎn)染并誘導(dǎo)卵巢癌SKOV-3細胞的凋亡，其生長增殖水平與空白對照組和空載體對照組無明顯差異，細胞的形態(tài)未見明顯變化。體內(nèi)荷瘤實驗結(jié)果顯示，有特異性質(zhì)粒干擾實驗組裸鼠的腫瘤生長速度、體積及質(zhì)量均明顯低于空白對照組和空載體對照組，且瘤組織中均存在ATF5表達，表達較其他兩組弱；光學(xué)顯微鏡下分裂象較其他兩組明顯減少。上述研究結(jié)果證實，沉默ATF5基因有可能達到促進腫瘤細胞凋亡、抑制腫瘤生長的目的，ATF5值得作為卵巢癌基因治療的重要候選基因之一。

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