馬金龍，褚言琛，張成棟，鄒云雯

(青島大學(xué)附屬醫(yī)院骨科，山東 青島 266003)

骨折愈合是一個(gè)復(fù)雜而連續(xù)的過(guò)程，分為血腫炎癥機(jī)化期、原始骨痂形成期、骨板形成塑形期，三者之間是相互交織逐漸演進(jìn)的過(guò)程，其中，成骨細(xì)胞的作用貫穿整個(gè)骨折愈合過(guò)程[1]。細(xì)胞外基質(zhì)對(duì)細(xì)胞的形態(tài)、結(jié)構(gòu)、功能等具有重要的影響，而基底膜蛋白多糖是細(xì)胞外基質(zhì)的關(guān)鍵組成部分[2]，具有傳遞細(xì)胞間信號(hào)的重要作用[3]?；啄さ鞍锥嗵鞘羌?xì)胞外基質(zhì)之一，本文研究其與成骨細(xì)胞之間的關(guān)系，探討其對(duì)骨折愈合的作用，以期為骨折愈合提供理論依據(jù)。現(xiàn)將結(jié)果報(bào)告如下。

1 材料和方法

1.1 成骨細(xì)胞提取及培養(yǎng)

取12 h內(nèi)新生大鼠8只(不分質(zhì)量、不分雌雄，購(gòu)自青島市藥物科學(xué)研究所)，25 g/L碘附常規(guī)消毒3 min，斷頭，取光滑顱骨，PBS液中浸洗后剪成直徑約0.5 mm大小的碎片，浸入2.5 g/L胰蛋白酶消化，離心，去上清液， 應(yīng)用1 g/L的Ⅱ型膠原酶消化，離心，取細(xì)胞沉淀，用PBS液洗滌后濾網(wǎng)濾除雜質(zhì)，以DMEM低糖培養(yǎng)液重懸細(xì)胞，吹打后接種，培養(yǎng)箱傳代培養(yǎng)。

1.2 成骨細(xì)胞的鑒定

應(yīng)用茜素紅法(鈣化結(jié)節(jié)染色)：取第3代成骨細(xì)胞，胰酶消化完全后接種于蓋玻片上，置于6孔培養(yǎng)板上培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，待接種成功后，取出蓋玻片，PBS沖洗，甲醛固定，去固定液后10 g/L茜素紅染色，37 ℃孵育30 min，PBS沖洗3次后拍照。

1.3 細(xì)胞增殖活性檢測(cè)

取生長(zhǎng)活躍的第3代成骨細(xì)胞，隨機(jī)分為基底膜蛋白多糖抑制劑組(A組)、空白對(duì)照組(B組)、低氧狀態(tài)下基底膜蛋白多糖抑制劑組(C組)、低氧狀態(tài)下對(duì)照組(D組)。在96孔板中每孔加100 μL配

制好的細(xì)胞懸液培養(yǎng)24 h。然后A組每孔加基底膜蛋白多糖抗體(1∶100培養(yǎng)基稀釋后)10 μL及細(xì)胞培養(yǎng)液(含體積分?jǐn)?shù)0.10胎牛血清、100 kU/L青霉素以及100 mg/L鏈霉素的DMEM低糖培養(yǎng)液)10 μL；B組每孔加20 μL細(xì)胞培養(yǎng)液；C組每孔加濃度150 μmol/L的二氯化鈷(CoCl2，細(xì)胞培養(yǎng)液稀釋)10 μL及串珠素抗體(1∶100)10 μL；D組每孔加150 μmol/L的CoCl2溶液10 μL及細(xì)胞培養(yǎng)液10 μL。另設(shè)置空白孔10個(gè)，即只有培養(yǎng)液而沒(méi)有細(xì)胞。將培養(yǎng)板在培養(yǎng)箱中分別培養(yǎng)24、48、72 h，每組中每個(gè)時(shí)間點(diǎn)增設(shè)10個(gè)檢測(cè)復(fù)孔。在每個(gè)時(shí)間點(diǎn)各組各孔均加入CCK溶液10 μL。然后置入培養(yǎng)箱孵育2 h后用酶標(biāo)儀測(cè)定450 nm處的吸光度(A)，計(jì)算細(xì)胞增殖活性。細(xì)胞增殖活性(%)=[A(加藥)-A(空白)]/[A(0加藥)-A(空白)]×100%。A(加藥)：具有細(xì)胞、CCK溶液和藥物溶液孔的吸光度；A(空白)：具有培養(yǎng)液和CCK溶液而沒(méi)有細(xì)胞孔的吸光度；A(0加藥)：具有細(xì)胞、CCK溶液而沒(méi)有藥物溶液孔的吸光度。

1.4 ELISA法檢測(cè)成骨細(xì)胞中骨形態(tài)發(fā)生蛋白2(BMP-2)的表達(dá)

在6孔板中每孔加1 mL細(xì)胞懸液培養(yǎng)24 h后，換等量無(wú)血清培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)12 h，按1.3方法分為A、B、C、D共4組，A組加基底膜蛋白多糖抗體100 μL及細(xì)胞培養(yǎng)液100 μL；B組加細(xì)胞培養(yǎng)液200 μL；C組加150 μmol/L的CoCl2溶液100 μL及串珠素抗體100 μL；D組加150 μmol/L的CoCl2溶液100 μL及細(xì)胞培養(yǎng)液100 μL。持續(xù)培養(yǎng)24、48、72、96 h后，以3 000 r/min離心10 min，取細(xì)胞上清液。設(shè)置標(biāo)準(zhǔn)品孔和樣本孔, 用酶標(biāo)儀測(cè)定450 nm波長(zhǎng)處吸光度(A)值。通過(guò)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線求標(biāo)本中BMP-2的濃度。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié) 果

2.1 各組成骨細(xì)胞增殖活性比較

隨培養(yǎng)時(shí)間增加，4組成骨細(xì)胞增殖活性均升高，差異有顯著性(F=14.62～960.06，P<0.05)。培養(yǎng)24、48 h，A組與B組比較、C組與D組比較成骨細(xì)胞增殖活性均降低，差異有顯著性(t=4.51～18.04，P<0.05)；培養(yǎng)72 h各組比較差異無(wú)顯著性(P>0.05)。見(jiàn)表1。

2.2 各組BMP-2表達(dá)比較

隨培養(yǎng)時(shí)間增加，4組BMP-2表達(dá)均增加，差異有顯著性(F=234.04～1 667.83，P<0.05)。培養(yǎng)24、48、72、96 h，A組與B組比較、C組與D組比較成骨細(xì)胞BMP-2表達(dá)降低，差異有顯著意義(t=6.61～30.50,P<0.05)。見(jiàn)表2。

表1 各組細(xì)胞增殖活性比較

表2 各組培養(yǎng)不同時(shí)間BMP-2表達(dá)比較

3 討 論

3.1 基底膜蛋白多糖對(duì)成骨細(xì)胞早期增殖的影響

細(xì)胞外基質(zhì)對(duì)細(xì)胞增殖和分化有重要的調(diào)控作用，其中很大一部分作用要通過(guò)細(xì)胞外基質(zhì)中的蛋白聚糖發(fā)揮?；啄さ鞍锥嗵鞘羌?xì)胞分泌到細(xì)胞外發(fā)揮作用的蛋白多糖，用基底膜蛋白多糖抗體阻斷其作用的方法在理論上是可行的。有研究表明，低氧狀態(tài)下或用基底膜蛋白多糖抗體中和內(nèi)源性基底膜蛋白多糖，大鼠血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖和對(duì)成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子的反應(yīng)均降低，這可能是通過(guò)抑制黏著斑激酶(FAK)介導(dǎo)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑實(shí)現(xiàn)的[6]。

本文的結(jié)果顯示，在成骨細(xì)胞增殖早期(48 h內(nèi))，無(wú)論是常氧狀態(tài)還是低氧狀態(tài)下，阻斷細(xì)胞外基底膜蛋白多糖后，細(xì)胞的增殖活性明顯下降，差異有顯著性，表明基底膜蛋白多糖對(duì)成骨細(xì)胞早期的增殖活性具有重要意義?；啄さ鞍锥嗵荋S側(cè)鏈與生長(zhǎng)因子結(jié)合，調(diào)節(jié)細(xì)胞因子的活性，影響細(xì)胞的增殖[7-8]。同時(shí)，HS側(cè)鏈具有調(diào)節(jié)細(xì)胞黏附的作用，其核心蛋白與側(cè)鏈的協(xié)同作用對(duì)于細(xì)胞黏附是必需的[9]。這可能進(jìn)一步影響了細(xì)胞的增殖活性。

3.2 基底膜蛋白多糖對(duì)成骨細(xì)胞晚期增殖的影響

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，在成骨細(xì)胞增殖的晚期(72 h后)，A組、C組細(xì)胞的增殖活性與B組、D組比較，差異無(wú)顯著性。細(xì)胞因子可有多種信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，成骨細(xì)胞加入基底膜蛋白多糖抗體后再培養(yǎng)72 h，其阻斷細(xì)胞外基底膜蛋白多糖對(duì)細(xì)胞因子的影響可能通過(guò)其他通路的代償作用而減弱。而且在培養(yǎng)72 h后，成骨細(xì)胞數(shù)目逐漸增多，細(xì)胞密度較大，基底膜蛋白多糖對(duì)細(xì)胞聚集、黏附等作用的影響可能不明顯。提示其可能主要在細(xì)胞增殖的早期發(fā)揮重要作用。但低氧依然明顯影響了成骨細(xì)胞的增殖活性，說(shuō)明低氧對(duì)成骨細(xì)胞的增殖影響是全面的，其原因可能涉及細(xì)胞內(nèi)、細(xì)胞外多種機(jī)制。

3.3 基底膜蛋白多糖對(duì)成骨細(xì)胞分泌BMP-2影響

研究顯示，BMP-2有促進(jìn)體外培養(yǎng)的成骨細(xì)胞分化和誘導(dǎo)其成骨的能力。GUTIERREZ等[10]證實(shí)，BMP-2誘導(dǎo)C2C12細(xì)胞向成骨細(xì)胞分化時(shí)，能夠促進(jìn)多種細(xì)胞外基質(zhì)中蛋白多糖的分泌，其中就包括含有HS側(cè)鏈的基底膜蛋白多糖。這說(shuō)明骨髓干細(xì)胞在向成骨細(xì)胞分化過(guò)程中，BMP-2能夠增強(qiáng)基底膜蛋白多糖的表達(dá)。BMP-2與基底膜蛋白多糖通過(guò)互相作用進(jìn)一步增強(qiáng)其對(duì)成骨的促進(jìn)作用。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，各個(gè)時(shí)間點(diǎn)A組、C組成骨細(xì)胞BMP-2表達(dá)量均較B組、D組明顯降低，提示基底膜蛋白多糖對(duì)BMP-2的合成有促進(jìn)作用。

綜上所述，在成骨細(xì)胞增殖早期基底膜蛋白多糖對(duì)成骨細(xì)胞增殖活性有顯著影響，并對(duì)成骨細(xì)胞分泌BMP-2具有明顯的促進(jìn)作用。然而，基底膜蛋白多糖對(duì)骨折愈合的促進(jìn)作用仍待進(jìn)一步的研究，其臨床意義也需要進(jìn)一步探討。

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