徐根娣, 陳析豐, 柯卡茹

(浙江師范大學 化學與生命科學學院， 金華 321004)

減數(shù)分裂和染色體行為觀察是遺傳學的經(jīng)典實驗，有利于學生深刻認識遺傳學規(guī)律和提高教學質(zhì)量。恰當?shù)倪x擇實驗材料，高質(zhì)量的制片技術(shù)，對幫助學生理解減數(shù)分裂過程中同源染色體發(fā)生配對和分離，非同源染色體重新組合或部分同源染色體間的交換，具有非常重要的意義[1]。減數(shù)分裂的動物取材主要是蝗蟲。因蝗蟲染色體數(shù)目較少，染色體較大，并且雄性蝗蟲在繁殖季節(jié)中處于減數(shù)分裂各個時期的細胞多，在實驗中容易觀察到，因而入選實驗教材[2]。但是在實際教學過程中，學生在有限時間內(nèi)不易找出減數(shù)分裂各時期及其對應特征，且制片速度慢，制出的片子效果不好，如有的染色不深或未染上色，甚至觀察不到分裂相。因此，根據(jù)筆者多年的實踐經(jīng)驗，從蝗蟲品種、捕捉時間和精細管取材部位來獲取分裂相較多的細胞，并結(jié)合醋酸洋紅染液分步轉(zhuǎn)移染色，提高染色效果，從而提高實驗效率和獲得較好教學效果。

1 蝗蟲精巢材料的篩選

1.1 蝗蟲品種和捕捉時間選擇

浙江金華的10月—11月份是蝗蟲繁殖高峰期，本試驗在10月20日到10月30日之間用捕蟲網(wǎng)捕捉。為了解一天中是否存在分裂相最旺盛的時段，按早、中、晚3個時間段進行捕捉。早、中、晚時間安排分為早9:30—10:30，中12:30—13:30，晚16:30—17:30。在校園附近操場分別捕捉青脊竹蝗、疣蝗、稻蝗和笨蝗的雄性成體，每個品種8～10只，將蟲體的翅膀和后肢剪去，以免飛走，按品種分別放入200 mL燒杯中，扣上蓋子備用。

1.2 精巢取材部位的選擇

分別選取蝗蟲精細管的不同部位進行制片觀察，從中篩選出分裂相較多的部位。第1種方法為三段取材法，即蝗蟲精細管分為前、中、后3個部分，前段為靠近精細管圓端處，中部為精細管中部，后端為精細管細端處(圖1)。第2種方法為二段取材法，即把蝗蟲精細管從中部均勻分為2段。

2 材料與方法[3-6]

2.1 解剖材料

對采集來的不同蝗蟲品種的雄性個體進行活體解剖。分別將已剪去翅膀和后肢的雄性蝗蟲取出，用手術(shù)剪去頭部，沿蟲體胸腹部中間從頭部端向尾部端剪開，并撐開已解剖的腹部體壁，用小鑷子先將胃腸等器官夾出棄去后，在體壁處可見深黃色的精巢，夾出精巢，放入PBS緩沖液中去除其表面的結(jié)締組織等附著物。然后，換入質(zhì)量分數(shù)為0.25%KCl低滲30 min，使細胞膨脹，利于染色體鋪展開來。再轉(zhuǎn)入卡諾固定液(無水乙醇∶冰醋酸=3∶1)中固定10～24 h，期間換1～2次固定液，充分脫脂。固定結(jié)束后，深黃色精巢變成肉眼能見由細管組成的白色精巢，直接放入75%乙醇，并置4℃的冰箱保存。

2.2 制片操作

以往的實驗大多采用一次染色法[7]。在本實驗中采用不同濃度的醋酸洋紅染液分步轉(zhuǎn)移染色。主要步驟：隨機選取已固定并保存的蝗蟲精巢，按每個品種每個捕捉時間段2只蝗蟲精巢的全部精細管制片。取整個精巢于加有0.5%醋酸洋紅染液的染色盤中，小心將精細管全部分開，染色10～15 min，然后分別取精細管放于加有1～2滴1%醋酸洋紅染液的載玻片中央，用鋒利的刀片將細管分成3段或2段，彼此分開，再染色3～5 min，蓋上蓋玻片，同時覆上吸水紙，壓片。壓片時左手拇指或食指壓住左側(cè)蓋玻片以幫助固定，防止蓋玻片的滑動，用拇指指腹垂直地用力加壓，為使細胞分散，也可用帶橡皮頭的鉛筆，用橡皮頭對準材料處輕敲，后拿載玻片對光觀察，見標本呈薄霧狀即可觀察。

2.3 制片觀察

將制備好的制片放在顯微鏡的載物臺上，先用低倍鏡觀察，再用高倍鏡，調(diào)節(jié)顯微視野的明暗度進行觀察。觀察細胞分裂相中不同形態(tài)的染色體，根據(jù)所學的理論指導，判斷出細胞的分裂時期。

3 結(jié)果與分析

3.1 蝗蟲品種

分別對青脊竹蝗、疣蝗、稻蝗和笨蝗的減數(shù)分裂制片進行觀察(表1)。結(jié)果表明，稻蝗具有分裂相的制片數(shù)、2～3個減數(shù)分裂時期的制片數(shù)、4個以上減數(shù)分裂時期的制片數(shù)遠遠高于其它3個蝗蟲品種，其次是笨蝗，青脊竹蝗和疣蝗的具有分裂相、2～3個減數(shù)分裂時期的制片數(shù)和4個以上減數(shù)分裂時期的制片數(shù)均較少?？梢姕p數(shù)分裂實驗結(jié)果的好壞與蝗蟲的品種有關，稻蝗是較好的蝗蟲材料。

3.2 蝗蟲捕捉時間

為了明確蝗蟲的減數(shù)分裂是否與蝗蟲的時間活動節(jié)律有關，選取早(9:30—10:30)、中(12:30—13:30)和晚(16:30—17:30)3個時間段捕獲蝗蟲。早、中和晚具有分裂相的制片百分數(shù)分別為43.2%、43.2%和44.7%，2～3個分裂時期的制片百分數(shù)在早、中和晚分別是29.1%、28.9%和30.1%，4個以上分裂在早、中和晚時期的制片百分數(shù)為10.2%、10.2%和11.2%。4個品種的蝗蟲具有分裂相與減數(shù)分裂制片數(shù)在3個時間段內(nèi)接近，可見時間節(jié)律并不是影響精母細胞分裂的主要因素。

表1蝗蟲減數(shù)分裂情況

3.3 取材部位

稻蝗的精細小管后端膨大非常明顯(圖1A)，而疣蝗的精細小管呈細長狀，后端無明顯膨大(圖1B)。取材時在體視鏡下將櫛比排列的精細管撥開，三段取材法中選取精細管圓端處和精細管中部膨大明顯的精細小管(圖1A)，或是二段取材法中選取精細管靠近圓端處，可以觀察到有較多的減數(shù)分裂相(表2, 圖2 A和B)。而后端無明顯膨大的精細小管，沒壓出內(nèi)容物，處于其分裂相較少或沒有(圖1B)。因此，選材時應有針對性地挑選后端膨大明顯的精細小管(圖1A)，使處于分裂相的細胞數(shù)目穩(wěn)定。

圖1 稻蝗(A)和疣蝗(B)的精細小管

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圖2稻蝗細胞的減數(shù)分裂觀察(A, B)

Fig 2 The meiosis observation inOxyachinensisThunb (A, B)

4 體會

“減數(shù)分裂”既是生物有性生殖過程中的一個重要階段，也是遺傳學三大規(guī)律的細胞學基礎[8]。針對實驗教學中存在的問題，筆者進行了一系列探究，有如下體會：

1) 選材方面，在10月—11月份捕捉稻蝗品種，處于減數(shù)分裂相的細胞數(shù)目多，可以大大提高實驗成功率。在開展減數(shù)分裂實驗時，在體視鏡下將櫛比排列的精細小管撥開，有針對性的挑選后端膨大精細小管，挑取其中一條精細小管的后端膨大處(1/2)放在載玻片上觀察，使實驗結(jié)果更為明顯?；蚴侨?～3條的精細管小段一起看，注意小段之間分開些，避免壓片時的重疊，這樣可彌補多個分裂相不能在一張片子上觀察到的缺陷。

2) 在實驗技術(shù)改進方面，本次試驗采用醋酸洋紅染液分步轉(zhuǎn)移染色，使染色充分，不會出現(xiàn)染色不深及染不上色的現(xiàn)象。在試驗中也做過堿性品紅與醋酸洋紅的比較，前者染色快、深，染色體易觀察，但細節(jié)不易看清，并且試劑配制要經(jīng)約2周后才能染色力增強[9, 10]。后者著色較淺，但能看清細節(jié)，特別是細胞邊界狹隘處，和細胞重疊與否易于區(qū)分，后者當天可用，可以更有效地提高染色體的固定效果。因此，選用醋酸洋紅染液分步轉(zhuǎn)移染色學生更易觀察到明顯的實驗效果。染色時也可以直接在載玻片上染色，但要注意在染色過程中及時加染液以免材料干燥，如果染液邊界出現(xiàn)干燥，觀察時要換載玻片，以防影響觀片效果。

3) 關于壓片，經(jīng)常有學生由于壓片時滑動玻片，導致顯微鏡下的細胞變形，使實驗失敗。因此可以用左手拇指或食指壓住左側(cè)蓋玻片來幫助固定，然后再壓片。壓片后有時會有細胞重疊現(xiàn)象，一方面可用帶橡皮頭的鉛筆，用橡皮頭對準材料處輕敲，使細胞分散；另一方面可以利用顯微鏡光圈，光照強度等方法來觀察細胞邊緣，來確定分裂時象。

4)材料保存期1年為佳，雖然2～3年的材料也能觀察到分裂相，但時間過長會使精細管收縮，增加操作難度，特別對于學生經(jīng)驗不足，操作不熟練的情況下，影響制片，觀察效果大打折扣。

5 結(jié)語

減數(shù)分裂實驗中通過蝗蟲材料的合理化篩選，確定稻蝗品種為實驗材料，并挑選2～3條后端膨大精細小管，選取后端膨大處(1/2)觀察，這是實驗教學取得成功的基本保證。染色體制備過程通過醋酸洋紅染液分步轉(zhuǎn)移染色，進一步提高實驗成功率，使學生牢固掌握各個減數(shù)分裂時期染色體特征，深刻理解遺傳學基本定律。

參考文獻:

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[9]郭善利, 劉林德. 遺傳學實驗教程[M]. 第2版. 北京: 科學出版社, 2010: 4-7.

[10]劉祖洞, 江紹慧. 遺傳學實驗[M]. 第2版. 北京: 高等教育出版社, 1999: 208-209.