張 銳， 蘭文升， 賀秀媛， 朱家增， 劉 葒， 史秀杰， 歐小雷

(1. 深圳出入境檢驗檢疫局動植物檢驗檢疫技術(shù)中心 深圳市外來有害生物檢測技術(shù)研發(fā)重點實驗室，深圳 518045； 2. 廣東海洋大學(xué) 實驗教學(xué)部現(xiàn)代生化中心，廣東 湛江 524088； 3. 河南農(nóng)業(yè)大學(xué) 牧醫(yī)工程學(xué)院動物醫(yī)學(xué)系， 鄭州 450002)

大田軟海綿酸(okadaic acid, OA) 及其衍生物是腹瀉型貝類毒素(DSP)毒素的主要組分, 它能夠抑制蛋白質(zhì)磷酸酶PP1A和PP2A，導(dǎo)致細(xì)胞蛋白質(zhì)過磷酸化[1]，從而降低了PP1和PP2A對正常細(xì)胞所具有的抑癌作用，促進脂質(zhì)過氧化[2]。有關(guān)報道表明，在低濃度不能引起機體劇烈毒性反應(yīng)時，OA成為一種潛在的腫瘤促進物和誘發(fā)劑，可誘導(dǎo)多種類型細(xì)胞的凋亡[3， 4]。

有報道氧自由基(Reactive oxygen species)在細(xì)胞信號肽中發(fā)揮很重要的作用，并主要存在于細(xì)胞增殖和凋亡過程中[5]。也有研究表明外源性污染物進入生物體后， 會導(dǎo)致大量活性氧自由基的產(chǎn)生[6]，它可以與DNA、蛋白質(zhì)和多元不飽和脂肪酸作用，造成DNA鏈斷裂和氧化性損傷、蛋白-蛋白交聯(lián)、蛋白-DNA交聯(lián)和脂質(zhì)過氧化。脂質(zhì)過氧化是造成生物體氧化損傷的主要原因，它使脂的通透性增加，膜結(jié)構(gòu)及其功能受到損傷，最終對生物體造成損傷[7]?？寡趸到y(tǒng)包括還原性谷胱甘肽(GSH)，過氧化氫酶(CAT), 超氧化物歧化酶(SOD)等，在消除氧自由基，維持細(xì)胞氧化還原平衡中發(fā)揮重要作用。盡管有很多報告指出OA能夠誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，但是各種信號之間的轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的精確連接以及它們的活化機制，到目前為止還不是很清楚。在我們的學(xué)習(xí)中，就關(guān)于OA能引起細(xì)胞凋亡和氧自由基的關(guān)系，測定在消除自由基和抗氧化反應(yīng)中起重要作用的3種物質(zhì)：還原性谷胱甘肽(GSH)、過氧化氫酶(CAT)、 超氧化物歧化酶(SOD)的活性變化，旨在找出其中可能的特異性敏感標(biāo)識物，也為后續(xù)試驗奠定基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 毒素及試劑

軟海綿酸(OA)購自伊普瑞斯科技有限公司(17.7 μM/L 14.2 μg/mL)，毒素標(biāo)準(zhǔn)品用于攻毒時稀釋10倍。甲醇(小鼠腹膜半數(shù)致死量260 mg/kg)；實驗所用試劑盒:過氧化氫酶(CAT)測定試劑盒；超氧化物岐化酶(SOD)測定試劑盒；還原性谷胱甘肽(GSH)測定試劑盒均購自南京建成生物技術(shù)公司。

1.2 實驗器械及儀器

制冰機(GRANT FM 70A)；高壓滅菌鍋(SYSTEC VX-100;HIRAYAMA)；微孔板式連續(xù)光譜測試系統(tǒng)(Spectra max plus384)；離心機(Mikro 22 R)。

1.3 實驗動物

Balb/C實驗鼠(雄性)，體重20～30 g，年齡均為5周齡。購自北京大學(xué)第三附屬醫(yī)院動物房。

1.4 鼠的攻毒方式與劑量

攻毒劑量依據(jù)NRC小鼠腹腔注射的LD50(192 μg/kg)進行劑量的確定。將實驗鼠隨機分為5組，每組10只。劑量組分為：高劑量組(96 μg/kg)，中劑量組(48μg/kg)，低劑量組(24 μg/kg)，溶劑對照組和空白對照組。溶劑對照所用為甲醇(Methanol)，按照高劑量組(96 μg/kg)注射劑量注射。于攻毒24 h后取其肝臟制備10%組織勻漿液，然后測定酶活含量。

1.5 指標(biāo)測定

染毒24 h后處死小鼠取出肝臟，制備10%組織勻漿，按照購買的測試試劑盒的操作說明進行各種指標(biāo)的測定。

1.610%組織勻漿的制備

1)取組織塊(0.2～1 g)最少可到2～5 mg，在冰冷的生理鹽水中漂洗，除去血液，濾紙拭干，稱重，放入5或10 mL的小燒杯內(nèi)。

2)用移液管量取預(yù)冷的勻漿介質(zhì)(pH值7.4, 0.01 mol/L Tris-HCL, 0.0001M/LEDTA-2Na, 0.01 mol/L蔗糖0.8%的氯化鈉溶液)或者用0.86%冷生理鹽水，勻漿介質(zhì)或生理鹽水的體積總量應(yīng)該是組織塊重量的9倍，用移液管或移液器取總量的2/3的勻漿介質(zhì)或生理鹽水于燒杯中，用眼科小剪盡快剪碎組織塊(天然操作時要在冰水浴中進行，將盛有組織的小燒杯放入冰水中)。

3)將剪碎的組織倒入玻璃勻漿管中，再將剩余的1/3勻漿介質(zhì)或生理鹽水沖洗殘留在燒杯中的碎組織塊，一起倒入勻漿管中進行勻漿，左手持勻漿管將下端插入盛有冰水混合物的器皿中，右手將搗桿垂直插入套管中，上下轉(zhuǎn)動研磨數(shù)十次(6～8 min)，充分研碎，使組織勻漿化。

4)將制備好的10%勻漿用普通離心機或低溫低速離心機3000 r/min左右離心10～15 min。

5)樣品放于4℃保存，進行酶活測定。

1.7 數(shù)據(jù)統(tǒng)計

使用SPSS9.1分析軟件進行數(shù)據(jù)分析。劑量組組間差異性采用t檢驗的方式表示，P<0.05表示差異有顯著變化。

2 結(jié)果

2.1 OA毒素對小鼠肝臟GSH活性的影響

小鼠肝臟GSH活性隨OA的濃度變化如圖1所示。小鼠染毒24 h后，溶劑對照組(甲醇)和空白對照組的GSH活性顯著性不明顯(P>0.05)，在試驗所設(shè)的各劑量組GSH活性明顯低于空白對照組(P<0.05)，隨著染毒濃度的增加，GSH的活性也逐漸降低，在高劑量組(96 μg/kg)GSH的活性最小，但是高劑量組(96 μg/kg)和中劑量組(48μg/kg)的GSH活性變化值差異性不顯著(P>0.05)。

*—與對照組比較P<0.05。

2.2 OA毒素對小鼠肝臟CAT的活性的影響

小鼠肝臟CAT活性隨OA濃度變化如圖2所示，小鼠在染毒24 h后，溶劑對照(甲醇)組和空白對照組的CAT活性沒有顯著差異(P>0.05)，染毒濃度在低劑量組(24 μg/kg)時，CAT活性比起空白對照組就已受到顯著(P<0.05)的抑制效應(yīng)。隨著染毒濃度的升高，各濃度組受到的抑制效應(yīng)越強烈，在高劑量組(96 μg/kg)時CAT活性達(dá)到最小值。

*—與對照組比較P<0.05。

2.3 OA毒素對小鼠肝臟SOD的活性的影響

小鼠肝臟SOD活性隨染毒濃度的變化如圖3所示，小鼠在染毒OA, 24 h后溶劑對照組(甲醇)和空白對照組的SOD活性差異不顯著(P>0.05)。染毒濃度在低劑量組(24 μg/kg)時SOD的活性已受到顯著的抑制作用(P<0.05)，隨著染毒濃度的增高，SOD的活性受到的抑制效應(yīng)也越強，在高劑量組(96 μg/kg)時SOD活性最小，但是數(shù)據(jù)統(tǒng)計顯示各濃度組差異并不顯著(P>0.05)。

*—與對照組比較P<0.05。

3 結(jié)論

小鼠肝臟各種酶GSH、CAT、SOD的活性,小鼠在感染OA毒素后，隨著染毒濃度的增加，GSH的活性也逐漸降低，在高劑量組(96 μg/kg)GSH的活性最小，而CAT和SOD的活性，均為低劑量OA毒素對CAT和SOD的活性均有顯著抑制效應(yīng), 隨著染毒濃度的升高，各濃度組受到的抑制效應(yīng)越強烈，在高劑量組(96 μg/kg)時CAT活性達(dá)到最小值。

4 討論

隨著環(huán)境污染的加劇和水生生物棲居環(huán)境的日益惡化, 有毒藻類大量的繁殖對生物生理功能和抗氧化防御機制的影響受到了廣泛關(guān)注和探究。有研究認(rèn)為，因外來異物脅迫而引起抗氧化酶活性的改變， 可在一定程度上反應(yīng)出機體處于逆境脅迫下的生理狀態(tài)， 并對一些早期污染物具有生物指示作用[8， 9]。探討以抗氧化酶活性的變化規(guī)律作為污染監(jiān)測的生物標(biāo)識物的可能性成為一項十分重要的課題項目[10]。

本次研究的結(jié)果顯示，小鼠染毒24 h后，空白對照組和溶劑對照組的GSH的活性，CAT酶活性值和SOD酶活性變化顯著性不明顯(P>0.05)，說明溶劑甲醇對動物機體抗氧化酶系統(tǒng)沒有產(chǎn)生顯著性的影響，當(dāng)毒素作用于動物機體時不會產(chǎn)生顯著影響。GSH是存在于組織中消除氧化損傷的一種重要的分子, 機體GSH含量的變化直接也可以反應(yīng)機體抗氧化能力[11， 12]。本次研究試驗中，染毒劑量組的GSH活性顯著低于對照組，表明染毒OA后，肝細(xì)胞的抗氧化能力受到抑制，細(xì)胞膜的完整性受到損傷。GSH活性在高劑量組(96 μg/kg)和中劑量組(48 μg/kg)間差異性并不顯著(P>0.05)，表明在這2個劑量組間抑制效應(yīng)的增加并不明顯。表明在本試驗中這2個濃度毒素作用對GSH的含量變化沒有顯示出明顯的劑量-效應(yīng)關(guān)系。CAT是抗氧化脅迫反應(yīng)中最為重要的酶，它可以分解氧化脅迫和SOD岐化反應(yīng)產(chǎn)生的H2O2，保護細(xì)胞免受損傷[13]。在本次試驗中，染毒劑量組的CAT活性顯著低于對照組(P<0.05)，并且隨著染毒劑量的升高，CAT活性越來越低，各濃度差異性也很顯著(P<0.05)，顯示了一定的劑量-效應(yīng)關(guān)系。許多研究表明SOD是細(xì)胞抗氧化系統(tǒng)對抗細(xì)胞損傷的一種重要的酶，也是指示氧化脅迫的一種重要的指示酶[14]。在本次研究中，SOD活性受到顯著抑制(P<0.05)，表明肝臟細(xì)胞中存在大量氧自由基，并已經(jīng)引起細(xì)胞損傷和DNA損傷，從而導(dǎo)致SOD活性降低。隨著染毒劑量的增加，SOD活性變化不顯著，表明SOD在本次試驗的OA各個濃度組并不敏感。

已經(jīng)有大量有關(guān)毒素對小鼠中樞神經(jīng)系統(tǒng)急性毒性和免疫保護性研究[15-18]，但OA對小鼠肝臟各種免疫因子相關(guān)酶的影響尚鮮有報道。

通過本次試驗得知，OA毒素作用于動物機體后，會引起機體抗氧化物系統(tǒng)(CAT、SOD、 GSH)的活性的變化，其中以CAT活性變化較為顯著，呈現(xiàn)了良好的劑量-效應(yīng)關(guān)系，有望成為OA毒素的特異指示酶。同時也為我們進一步的細(xì)胞水平和分子水平的實驗奠定了一定的基礎(chǔ)。

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