王曉囡, 周 艷, 嚴(yán) 敏, 魯帥堯, 李 松, 孫茂盛, 李鴻鈞

(中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院 北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院 醫(yī)學(xué)生物學(xué)研究所；云南省重大傳染病疫苗工程技術(shù)研究中心；云南省重大傳染病疫苗研發(fā)實驗室, 昆明 650118)

胰島β細(xì)胞分化發(fā)育過程中，轉(zhuǎn)錄因子與信號通路的調(diào)控機(jī)制非常復(fù)雜，多種轉(zhuǎn)錄因子的時序表達(dá)，決定著胰腺的分化與發(fā)育進(jìn)程[1]。胰芽形成之初，反式作用因子胰腺十二指腸同源框蛋白1(Pancreatic duodenal homeobox 1, PDX-1)能夠啟動前體細(xì)胞向胰腺細(xì)胞包括所有外分泌與內(nèi)分泌細(xì)胞分化[2， 3]，而進(jìn)一步向內(nèi)分泌細(xì)胞分化則需要神經(jīng)元素3(Neurogenin 3, NGN3)、成對盒基因4 (paired box gene 4, PAX4)、NK6轉(zhuǎn)錄因子相關(guān)1 (NK6 transcription factor related, locus 1, NKX6. 1)等多種轉(zhuǎn)錄因子協(xié)同作用[4]。近年研究證明，PDX-1基因的活化及相關(guān)信號通路的啟動能夠使間充質(zhì)干細(xì)胞向胰腺β細(xì)胞方向分化，說明PDX-1基因在胰腺分化調(diào)控過程中起著“總開關(guān)”的作用[5, 6]。脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞(adipose mesenchymal stem cells， s)在體內(nèi)含量豐富，易于獲得，且可自體移植，在血糖平衡及激素產(chǎn)生方面也具有重要作用[7]，成為干細(xì)胞治療糖尿病的較為理想的干細(xì)胞資源。因此，構(gòu)建PDX-1腺病毒表達(dá)載體，以PDX-1腺病毒感染脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞，對其進(jìn)行重編程，以探索PDX-1在脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞中的表達(dá)情況，為進(jìn)一步研究ASCs向胰島β細(xì)胞分化過程中的作用與機(jī)制奠定基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 材料與試劑

SalⅠ、NotⅠ、PacⅠ等多種限制性內(nèi)切酶，T4 DNA ligase，PrimeSTAR HS DNA Polymerase，Lipofectamine 2000脂質(zhì)體均購自大連寶生物公司。質(zhì)粒提取試劑盒及膠回收試劑盒購自O(shè)MEGA公司。兔抗大鼠PDX-1IgG購自Cell signal公司。 Adenoviral vector system購自美國Strategen公司。引物由上海豐科生物有限公司合成。L-DMEM培養(yǎng)基購自Hyclone。吲哚美辛(indomethacin)、3-異丁基-1-甲基黃嘌呤(3-isobutyl-1-methylxanthine, IBMX)、油紅O(Oil Red-O)、β-甘油磷酸鈉(β-Glycero-phosphate disodium salt hydrate)、L-抗壞血酸-2-磷酸三鈉鹽(L-Ascorbic acid-2-phosphate)購自Sigma-Aldrich公司；細(xì)胞堿性磷酸酶(ALP)檢測試劑盒購自GENMED Scientifics 公司。RIPA蛋白裂解液購自碧云天公司。

1.2 方法

1.2.1PDX-1基因的PCR擴(kuò)增

以南京金斯瑞公司構(gòu)建的pUC57-PDX-1(PDX1 NM_022852.3)質(zhì)粒為模板，分別以P1，P2為引物，見表1，PCR擴(kuò)增PDX-1基因，PCR反應(yīng)體系為50 μL，2×PrimeSTAR GC buffer 25 μL，dNTP Mixture(2.5 mmol/L) 4 μL，P1(10 μmol/L) 1 μL，P2(10 μmol/L) 1 μL，pUC57-PDX-1質(zhì)粒1 μL，PrimeSTAR HS DNA Polymerase(2.5 U/μL) 0.5 μL，dH2O補足50 μL。反應(yīng)條件為98℃ 10 s；56℃ 5 s；72℃ 1 min，35 cycle。擴(kuò)增產(chǎn)物在質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1%瓊脂糖凝膠中電泳。

表1 PCR所用引物

1.2.2 穿梭質(zhì)粒pShuttle-CMV-PDX-1的構(gòu)建

PDX-1的PCR產(chǎn)物經(jīng)過膠回收純化后與pShuttle-CMV質(zhì)粒同時用SalⅠ和NotⅠ雙酶切，分別膠回收852 bp PDX-1基因片段與7500 bp載體片段，T4DNA連接酶連接兩個目的片段，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài)，篩選并擴(kuò)增pShuttle-CMV-PDX-1質(zhì)粒的DH5α，抽提質(zhì)粒pShuttle-CMV-PDX-1。

1.2.3 pAdEasy-CMV-PDX-1腺病毒載體的構(gòu)建

1)PmeⅠ酶切線性化pShuttle-CMV-PDX-1，膠回收純化，并做CIAP去磷酸化處理。2)去磷酸化產(chǎn)物用PCR純化試劑盒進(jìn)行純化。3)將線性化質(zhì)粒pShuttle-CMV-PDX-1和pAdEasy-1質(zhì)粒共同加入電轉(zhuǎn)化BJ5183感受態(tài)細(xì)胞，冰浴30 min。4)將冰浴后的全部質(zhì)粒菌體混合物轉(zhuǎn)移至間距為2 mm的BioRad電轉(zhuǎn)杯中，電壓2.5 kV，電阻200 Ω，電容25 μF電轉(zhuǎn)。5)電轉(zhuǎn)結(jié)束后，加入800 μL LB培養(yǎng)基重懸菌體，37℃水浴45 min。6)將菌液涂布到含卡那霉素的LB瓊脂板上，37℃倒置培養(yǎng)過夜。7)篩選帶有pAdEasy-CMV-PDX-1病毒質(zhì)粒的BJ5183，提取pAdEasy-CMV-PDX-1質(zhì)粒。8)pAdEasy-CMV-PDX-1轉(zhuǎn)化XL-10感受態(tài)細(xì)胞，大量提取pAdEasy-CMV-PDX-1，對產(chǎn)物進(jìn)行酶切及測序鑒定。

1.2.4 重組腺病毒Ad-PDX-1的包裝、擴(kuò)增和滴度測定

HEK293細(xì)胞在含有體積分?jǐn)?shù)為10% FBS，100 U/mL 青霉素，100 U/mL 鏈霉素的H-DMEM培養(yǎng)液中于37℃、5% CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。待單層貼壁細(xì)胞貼壁率接近80%時，PacⅠ酶切線性化pAdEasy-CMV-PDX-1質(zhì)粒，用Lipof-ectamine2000脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染HEK293細(xì)胞。7～10 d后，大部分細(xì)胞病變并脫落時收毒，反復(fù)凍融3次，8000 r/min, 離心10 min，收集上清，再用收集的病毒液感染HEK293細(xì)胞大量擴(kuò)增病毒。用Reed-Muench法測定重組腺病毒的感染性滴度。

1.2.5 重組腺病毒Ad-PDX-1的形態(tài)學(xué)觀察

取5 μL 擴(kuò)增所得的重組腺病毒滴至臘盤上，將銅網(wǎng)蓋在病毒液上進(jìn)行吸附，銅網(wǎng)用重金屬鹽(磷鎢酸)進(jìn)行負(fù)染，吸走多余染料，等樣品干燥后將銅網(wǎng)置于透射電鏡下觀察。

1500 r/min離心10 min收集感染重組腺病毒24 h、48 h和72 h的HEK293 細(xì)胞，置于2.5%戊二醛(0.2 mol/L 二甲胂酸鈉緩沖液配制)中固定2 h；經(jīng)二甲胂酸鈉緩沖液漂洗3～5次；再將樣品置于1%四氧化鋨(鋨酸)溶液(0.2 mol/L 二甲胂酸鈉緩沖液配制)固定2 h；用二甲胂酸鈉緩沖液漂洗3～5次，置于緩沖液中過夜；將樣品依次放入30%、50%、70%、90%及100%丙酮中進(jìn)行脫水處理，每次10 min；配制環(huán)氧樹脂618，按比例與丙酮混合配制；然后將樣品依次放入環(huán)氧樹脂與丙酮1∶2、1∶1 溶液及純環(huán)氧樹脂中進(jìn)行浸透處理，每次2 h；將處理后的樣品放入模具，加入環(huán)氧樹脂，置于溫箱，40℃處理12～20 h，再經(jīng)60℃處理48～60 h進(jìn)行包埋；取出包埋塊，進(jìn)行修塊、切片處理；將超薄切片進(jìn)行染色處理：2%醋酸鈾染色30 min，蒸餾水沖洗；枸櫞酸鉛染色液染色30 min，蒸餾水沖洗；完成后靜置待切片干燥；最后經(jīng)透射電子顯微鏡觀察。

1.2.6 脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞的分離培養(yǎng)[8]

手術(shù)剪和鑷子用0.1%新潔爾滅浸泡消毒，大鼠斷頸處死后，在75%酒精中浸泡3 min, 無菌條件下取大鼠蹊部脂肪組織，在加有雙抗的PBS中洗3次以去除殘余的血跡，分離可見的血管和纖維成分，將組織剪碎后，加入與脂肪組織等體積的0.1%的Ⅰ型膠原酶，37℃消化40～60 min, 加入與Ⅰ型膠原酶等體積的含10%胎牛血清的L-DMEM培養(yǎng)基終止消化，過濾，1600 r/min離心8 min，棄上清，加入適量L-DMEM培養(yǎng)基(含15% 胎牛血清，100 U/mL 青霉素，100 U/mL 鏈霉素)，以1×106接種于T-25培養(yǎng)瓶中，置37℃，5% CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，4 d后換液。

待單層貼壁細(xì)胞貼壁率接近90%時，體積分?jǐn)?shù)為0.25%胰蛋白酶-4%EDTA消化細(xì)胞，按1∶2的比例傳代培養(yǎng)。每3～4 d傳代1次。

1.2.7 rASCs多向分化潛能鑒定[9]

1)成脂誘導(dǎo)。rASCs貼壁率接近90%時，按照圖1所示流程，誘導(dǎo)21 d后，棄去培養(yǎng)液，細(xì)胞經(jīng)PBS洗滌后，4%多聚甲醛室溫固定20 min，PBS 洗滌細(xì)胞2 次，3%油紅O工作液避光染色30 min，PBS 洗滌，于光學(xué)顯微鏡下直接觀察。

圖1 rASCs成脂誘導(dǎo)流程

2)成骨誘導(dǎo)。rASCs貼壁率接近70%后，加入成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)液(含有10% 胎牛血清+100 U/mL青霉素+100 U/mL鏈霉素+10 nmol/L地塞米松+10 mmol/Lβ-磷酸甘油鈉+150 μmol/L L-抗壞血酸的DMEM/F12)。以后每4 d按以上配方換1次溶液。成骨誘導(dǎo)至第21 d后，使用ALP檢測試劑盒對誘導(dǎo)細(xì)胞進(jìn)行堿性磷酸酶活性鑒定。

1.2.8 Ad-PDX-1感染rASCs及PDX-1在細(xì)胞中的表達(dá)

按 2.0×106/孔的接種密度將rASCs接種于六孔培養(yǎng)板，當(dāng)細(xì)胞匯合達(dá)到80%時，按照MOI=5.0加入相應(yīng)量的Ad-PDX-1病毒液，同時設(shè)立無腺病毒感染的ASCs對照組。48 h后，分別以P1，P2為引物，RT-PCR方法檢測目的基因PDX-1在rASCs中的轉(zhuǎn)錄情況，先用RNA快速提取試劑盒提取實驗組及對照組細(xì)胞總RNA，反轉(zhuǎn)錄合成cDNA, 再以cDNA為模板做PCR，反應(yīng)體系及條件如1.2.1中所述。同時，以免疫熒光法及Western blotting檢測PDX-1目的蛋白在rASCs中的表達(dá)情況。另外，檢測病毒感染rASCs 21 d時的表達(dá)情況，以驗證病毒在細(xì)胞中的持續(xù)表達(dá)能力。

1)免疫熒光檢測。分別將實驗組及對照組細(xì)胞爬片，先用PBS洗2次，再用-20℃預(yù)冷的純甲醇于4℃固定10 min, PBS洗3次，2% BSA 37℃封閉30 min，加入兔抗大鼠PDX-1一抗，4℃孵育過夜，PBS洗3次，F(xiàn)ITC標(biāo)記的羊抗兔二抗37℃孵育1 h，PBS洗3次，取出細(xì)胞爬片，滴加甘油封片，熒光顯微鏡下于激發(fā)波長488 nm，放大倍數(shù)200倍下觀察結(jié)果。

2)Western Blotting檢測。用RIPA裂解實驗組及對照組細(xì)胞獲得細(xì)胞蛋白液，取50 μL蛋白液與10 μL 5×上樣緩沖液混合，100℃變性10 min，12% SDS-PAGE膠電泳分離，電轉(zhuǎn)移至0.22 μm孔徑的硝酸纖維素膜，在體積分?jǐn)?shù)為5%脫脂奶粉/TBST的封閉液中，室溫封閉1 h，TBST漂洗3次，加入兔抗大鼠PDX-1一抗，4℃振蕩過夜。TBST漂洗3次，每次15 min, 加入HRP標(biāo)記的羊抗兔二抗，室溫振蕩1 h后TBST漂洗3次，化學(xué)顯色。β-actin做內(nèi)參。

2 結(jié)果

2.1 PCR獲取大鼠PDX-1基因

以pUC57-PDX-1質(zhì)粒為模板，以P1，P2為引物，PCR特異性擴(kuò)增大鼠PDX-1基因，PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳，電泳結(jié)果顯示大小約為852 bp的特異性條帶，該條帶為PDX-1基因的特異擴(kuò)增產(chǎn)物(見圖2)。

M—DL1000 DNA Maker； 1—大鼠PDX-1基因。

2.2 酶切鑒定重組腺病毒質(zhì)粒

SalⅠ與NotⅠ雙酶切pShuttle-CMV-PDX-1，陽性克隆產(chǎn)物為2條帶，大小分別為7500 bp、852 bp，見圖3A。pAdEasy-CMV-PDX-1用PacⅠ酶切，陽性克隆產(chǎn)物為2條帶，且小片段長度為3.0 kb或4.5 kb，本實驗篩選出的是4.5 kb的陽性克隆，見圖3B。所有酶切結(jié)果均與理論預(yù)期一致，表明PDX-1序列已成功插入pAdEasy-1載體中，且連接正確。

M—DL10000 DNA Maker；A—SalⅠ和NotⅠ雙酶切pShuttle-CMV-PDX-1結(jié)果；B—PacⅠ酶切pAdEasy-CMV-PDX-1結(jié)果。

圖3構(gòu)建的相關(guān)載體酶切鑒定結(jié)果

Fig 3 The results of enzyme cutting related vectors

2.3 腺病毒Ad-PDX-1的形態(tài)學(xué)觀察及滴度測定

PacⅠ酶切線性化pAdEasy-CMV-PDX-1質(zhì)粒，用Lipofectamine2000脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染HEK293細(xì)胞，7～10 d后，細(xì)胞聚集、細(xì)胞間隙增大、變圓、呈葡萄狀，見圖4。待大部分細(xì)胞病變后，反復(fù)凍融3次，收集病毒液。透射電鏡觀察復(fù)染的病毒顆粒，形態(tài)正常，直徑約為70～90 nm, 符合典型的腺病毒的20面體對稱結(jié)構(gòu)，見圖5。重組腺病毒感染HEK293細(xì)胞24 h, 48 h及72 h后，細(xì)胞超薄切片結(jié)果表明，病毒感染后細(xì)胞形態(tài)開始變圓、皺縮、呈現(xiàn)不規(guī)則形，細(xì)胞核較小，在細(xì)胞中分布有較多的腺病毒顆粒，并且隨著感染時間的增加，胞質(zhì)中的腺病毒顆粒也變多，見圖6。在重復(fù)擴(kuò)增，收集病毒后，用Reed-Munench法測定重組腺病毒Ad-PDX-1的感染性滴度為107CCID50/mL, 見圖7。

A、B、C分別為轉(zhuǎn)染7 d、9 d、10 d時的細(xì)胞形態(tài)。

圖5 透射電鏡觀察重組腺病毒負(fù)染結(jié)果

A、B、C分別為腺病毒感染HEK293細(xì)胞24 h、48 h、72 h后細(xì)胞超薄切片結(jié)果。

圖6重組腺病毒感染HEK293細(xì)胞后超微結(jié)構(gòu)觀察

Fig 6 Ultrastructural characteristics of HEK293 cells which were transfected by recombinant adenovirus after 24 hours

2.4 多向分化潛能鑒定結(jié)果

經(jīng)成脂誘導(dǎo)后的rASCs，形態(tài)由長梭形逐漸變圓，呈短圓梭形、橢圓形。誘導(dǎo)8 d后，在光鏡下可以看見折光性強(qiáng)的空泡提示脂滴開始形成，見圖8A。誘導(dǎo)21 d后的細(xì)胞經(jīng)油紅O 染色，可見胞漿內(nèi)有大量被染成紅色的脂滴，見圖8B，對照細(xì)胞始終未見被染色脂滴，見圖8C，說明rASCs在體外具有向脂肪細(xì)胞分化的潛能。

圖7 病毒滴度測定結(jié)果

圖8 rASCs的成脂誘導(dǎo)分化

經(jīng)成骨誘導(dǎo)后的rASCs，細(xì)胞出現(xiàn)聚集生長的傾向，呈多層網(wǎng)狀生長，見圖9A。誘導(dǎo)21 d后，對細(xì)胞進(jìn)行堿性磷酸酶(ALP)染色，ALP是成骨細(xì)胞分化的代表性酶，ALP 作為成骨細(xì)胞表型特征之一，在體外鈣化中起關(guān)鍵性作用，隨其升高的同時出現(xiàn)大量鈣鹽的沉積，ALP 活性越高，說明細(xì)胞向成骨細(xì)胞分化越明顯，實驗中誘導(dǎo)后細(xì)胞可以看見胞漿被染成藍(lán)黑色，見圖9B，對照組細(xì)胞中則無明顯著色，見圖9C。說明rASCs在體外具有向成骨細(xì)胞分化的潛能。

圖9 rASCs的成骨誘導(dǎo)分化

2.5 Ad-PDX-1感染rASCs后，PDX-1的表達(dá)情況

感染Ad-PDX-1的rASCs在48 h后可檢測到PDX-1基因的轉(zhuǎn)錄，而對照組則無PDX-1基因的轉(zhuǎn)錄(圖10)。免疫熒光法和Western blotting法均檢測到實驗組rASCs中轉(zhuǎn)錄因子PDX-1的高表達(dá)，而在對照組中則檢測不到其表達(dá)(圖11和圖12)。且病毒感染rASCs 21 d后，仍能檢測到PDX-1的轉(zhuǎn)錄與表達(dá)。

M—DL1000 DNA Maker; 1、3、5—分別為內(nèi)參β-Actin 的轉(zhuǎn)錄情況； 2、4—分別為Ad-PDX-1感染rASCs 48 h、21 d后，PDX-1轉(zhuǎn)錄情況； 6—rASCs對照組PDX-1轉(zhuǎn)錄情況。

圖10 PDX-1在實驗組及對照組中的轉(zhuǎn)錄情況

Fig 10 The transcription of PDX-1 in the experimental group and the control group

A1A2—Ad-PDX-1感染rASCs 48 h后，PDX-1表達(dá)情況(200×) ；B1B2—rASCs對照組PDX-1表達(dá)情況(200×)。

圖11免疫熒光法檢測PDX-1的表達(dá)情況

Fig 11 The expression of PDX-1 protein detected by immunofluorescence

1—rASCs對照組; 2—Ad-PDX-1感染rASCs 21 d; 3—Ad-PDX-1感染rASCs 48 h。

圖12 Wsetern blotting法檢測PDX-1的表達(dá)情況

Fig 12 The expression of PDX-1 protein detected by Wsetern blotting

3 討論

脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞因含量豐富，易于分離，因而受到廣泛關(guān)注[10]。本研究通過I型膠原酶消化法，連續(xù)傳數(shù)代后，可成功從脂肪中獲取高純度的rASCs。rASCs的基本特征為：貼壁生長，細(xì)胞呈纖維狀，旋渦排列。細(xì)胞多向分化潛能鑒定表明，rASCs可以分化為脂肪細(xì)胞和成骨細(xì)胞，這一結(jié)果證實了其具有較強(qiáng)的可塑性和多向分化潛能，符合間充質(zhì)干細(xì)胞的基本特征。

近年研究發(fā)現(xiàn)ASCs不僅具有多向分化潛能，在血糖平衡及激素產(chǎn)生方面也具有重要作用[7]，在治療糖尿病方面的研究也越來越多。腺病毒因其基因組重排頻率低，安全性較好，插入大片段外源性基因的潛力大，有較大的宿主范圍，外源基因表達(dá)水平較高等優(yōu)點[11]倍受研究者喜愛。本研究選用的腺病毒載體為人腺病毒5型，即復(fù)制缺陷型腺病毒。首先我們將PDX-1基因片段插入到pShuttle-CMV載體中，通過同源重組的方法，獲得了pAdEasy-PDX-1重組腺病毒質(zhì)粒。酶切鑒定與測序結(jié)果顯示目的基因片段PDX-1成功克隆至載體的多克隆位點。脂質(zhì)體法轉(zhuǎn)染HEK293細(xì)胞，轉(zhuǎn)染7 d細(xì)胞開始變圓，聚集，呈葡萄狀，即出現(xiàn)典型的細(xì)胞病變效應(yīng)。病毒復(fù)染后電鏡觀察，可見直徑約為70～90 nm, 呈20面體對稱結(jié)構(gòu)的病毒顆粒，符合典型的腺病毒特征。病毒感染HEK293細(xì)胞后，分時間段收集細(xì)胞，細(xì)胞超薄切片表明包裝獲得的腺病毒顆粒在HEK293細(xì)胞中成功擴(kuò)增。連續(xù)傳代3到4次，獲得大量具有穩(wěn)定感染性的重組腺病毒Ad-PDX-1，傳至第3代，病毒滴度達(dá)107CCID50/mL，已滿足本實驗需要。

酶切鑒定結(jié)果及測序結(jié)果均表明，該重組腺病毒載體含有PDX-1基因片段，且插入順序完全正確。為進(jìn)一步研究重組腺病毒Ad-PDX-1對rASCs的感染效率及目的基因在rASCs內(nèi)的表達(dá)情況，用Ad-PDX-1感染rASC 48 h后，通過RT-PCR、免疫熒光、Western blotting等證實，Ad-PDX-1對rASCs具有很高的感染能力，當(dāng)細(xì)胞的病毒感染復(fù)數(shù)(MOI)為5.0時，有90%以上的細(xì)胞被感染，說明Ad-PDX-1對rASCs具有較強(qiáng)的感染能力。免疫熒光結(jié)果證實，PDX-1目的產(chǎn)物能特異定位于細(xì)胞核內(nèi)，說明所構(gòu)建的腺病毒Ad-PDX-1表達(dá)的目的基因PDX-1具有核定位等轉(zhuǎn)錄因子共有的基本生物活性。RT-PCR及Western blotting結(jié)果表明，Ad-PDX-1感染rASCs 21 d后仍能檢測到PDX-1的轉(zhuǎn)錄及表達(dá)，為后續(xù)將大鼠脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞向胰島β細(xì)胞誘導(dǎo)分化奠定了基礎(chǔ)，為糖尿病的干細(xì)胞治療提供依據(jù)。

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