王法微王騏鄧宇，董金曄王南李曉薇李海燕

（1. 吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)生物反應(yīng)器與藥物開發(fā)教育部工程研究中心，長春 130118；2. 吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，長春 130118；3. 東北師范大學(xué)附屬中學(xué)，長春 130021）

磷脂酶C基因家族研究進(jìn)展

王法微1王騏3鄧宇1，2董金曄2王南1李曉薇1李海燕1

（1. 吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)生物反應(yīng)器與藥物開發(fā)教育部工程研究中心，長春 130118；2. 吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，長春 130118；3. 東北師范大學(xué)附屬中學(xué)，長春 130021）

磷脂酶C（Phospholipase C，PLC）基因是磷脂酶基因家族中的一個成員，它能夠水解磷脂酰肌醇4，5-二磷酸生成兩個重要的信使分子肌醇三磷酸和二酰甘油。在動物中磷脂酶C基因可以通過調(diào)節(jié)胞內(nèi)鈣離子的釋放以及激活蛋白激酶C來起作用，而植物中磷脂酶C可以參與植物對生物及非生物脅迫的調(diào)節(jié)，但其作用的具體方式仍不清楚。綜述了磷脂酶C基因的研究進(jìn)展，主要包括基因的分類、結(jié)構(gòu)以及其在不同逆境信號轉(zhuǎn)導(dǎo)中的作用方式。

PLC基因 肌醇三磷酸 二酰甘油 結(jié)構(gòu) 信號轉(zhuǎn)導(dǎo)

磷脂酶是一類能夠水解磷脂的酶類，按照其酶解磷脂位置的不同分為磷脂酶D、磷脂酶C、磷脂酶A1和磷脂酶A2，它們均在植物生長發(fā)育、生物脅迫及非生物脅迫中起重要的調(diào)控作用。磷脂酶C（Phospholipase C，PLC）可以水解磷脂生成一個分子的二酰甘油（diacyl glycerol，DAG）和一個含有磷酸集團(tuán)的小分子，這兩個第二信使分子在很多植物信號轉(zhuǎn)導(dǎo)中具有重要作用［1，2］。1987年，Melin等［3］克隆并鑒定了第一個植物磷脂酶C，并發(fā)現(xiàn)該基因受鈣離子調(diào)控，并且定位于細(xì)胞質(zhì)膜上。隨后，Yamamoto等［4］、Shi等［5］、Hirayama等［6］、Zhai等［7］和Vossen等［8］分別克隆了擬南芥、大豆、玉米和番茄的PLC基因，并證實PLC對不同磷脂酰肌醇均具有水解活性。近年來，人們發(fā)現(xiàn)PLC在植物對鹽、干旱、高溫及病害防御反應(yīng)中具有重要的調(diào)節(jié)作用，而PLC作用的主要方式為控制底物（PIP2）及其產(chǎn)物IP3、DAG的量來實現(xiàn)的［1，8，9］。但是，PLC通過調(diào)節(jié)IP3、DAG參與植物各種信號途徑的直接證據(jù)仍未找到。本文就近十幾年來國內(nèi)外PLC基因的研究進(jìn)展，闡述其分類以及結(jié)構(gòu)特點，并且綜述其參

與不同植物信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的方式，為PLC在植物逆境信號轉(zhuǎn)導(dǎo)中的研究進(jìn)展作一個簡要總結(jié)。

1 磷脂酶C的分類

磷脂酶C可以水解磷脂生成具有磷酸基團(tuán)的頭部和二酰甘油，其中帶有磷酸基團(tuán)的頭部根據(jù)底物的不同，又可以是肌醇磷酸、膽堿磷酸和乙醇胺磷酸等。PLC根據(jù)作用底物的不同可以分為非特異性PLC（Non-specific PLC，NPC）和磷脂酰肌醇特異性PLC（phosphoinositide-specific PLC，PI-PLC）。NPC可以水解PC、PE、PS、PG和PA［9，10］，生成DAG與帶有磷酸基團(tuán)的頭部。最初發(fā)現(xiàn)NPC時，它與植物中常見的PLC家族基因的關(guān)系不大，隨著研究的深入，人們發(fā)現(xiàn)擬南芥NPC與結(jié)核分支桿菌的PLC同源性相近，并且具有3個相似的結(jié)構(gòu)域。雖然NPC沒有PLC家族基因的C2、X、Y、EF等結(jié)構(gòu)域，但它仍含有一個磷酸酯酶結(jié)構(gòu)域，能夠水解磷脂，所以把它歸為PLC家族中的一個亞家族［11］；磷脂酶家族的另外一個成員PI-PLC是指信號中的一個重要調(diào)控酶。它可以水解磷脂酰肌醇生成DAG與肌醇磷酸，如肌醇二磷酸（Inositol bisphosphate，IP2）和肌醇三磷酸（Inositol triphosphate，IP3）。PI-PLC的功能在動物中已經(jīng)研究得十分清楚，但是其在植物中的功能人們卻知之甚少。

動物中含有的PLC可以分為6類13種，分別為 PLCβ1-4、PLCγ1-2、PLCδ1-5、PLCε、PLCζ和PLCη1-2［12］。在動物中，DAG能夠激活蛋白激酶C，IP3可以進(jìn)入胞液中控制內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中鈣離子的釋放。而植物中的PLC分類沒有動物中復(fù)雜、具體。植物中的PLC分為NPC和PI-PLC。目前，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)擬南芥基因組中存在9種PI-PLC、6種NPC和4種普通的PLC［10，13］。水稻基因組中含有9個PLC，其中4個屬于PI-PLC，另外5個均為NPC［2］。

2 磷脂酶C的結(jié)構(gòu)

磷脂酶C主要由PH結(jié)構(gòu)域、EF指型結(jié)構(gòu)、X結(jié)構(gòu)域、Y結(jié)構(gòu)域和C2結(jié)構(gòu)域組成。與動物中PLC相比，植物中PLC缺失了PH結(jié)構(gòu)域，結(jié)構(gòu)與動物中的PLCζ類似（圖1）［25］。最初PH結(jié)構(gòu)域被形容為一個大小約100個氨基酸殘基，在一個蛋白中重復(fù)出現(xiàn)兩次的結(jié)構(gòu)域?，F(xiàn)在已經(jīng)發(fā)現(xiàn)上百種蛋白中含有PH結(jié)構(gòu)域，這些蛋白主要包括絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶、酪氨酸蛋白激酶、小G蛋白調(diào)節(jié)因子、磷脂酰肌醇調(diào)控酶類以及細(xì)胞骨架相關(guān)蛋白等。大多數(shù)真核生物PLC中的PH結(jié)構(gòu)域均位于氮端，約130個氨基酸。有報道表明，PLCδ1中的PH結(jié)構(gòu)域可與PIP2結(jié)合并促進(jìn)PLCδ1運(yùn)動到膜的表面上去［14］。PLCβ2和PLCβ3的PH結(jié)構(gòu)域可以和G蛋白的βγ亞單位特異的結(jié)合［15］。PH結(jié)構(gòu)域也可和PIP2相互作用，調(diào)控PLCγ1的激活與轉(zhuǎn)運(yùn)［12，16］。因此可以總結(jié)出PH結(jié)構(gòu)域在PLC對底物的結(jié)合以及活性的調(diào)節(jié)起著重要的作用，但植物PLC中并沒有PH結(jié)構(gòu)域，植物PLC仍能夠水解膜上的磷脂而參與植物不同的生理反應(yīng)與代謝調(diào)控。所以植物PLC的作用方式與動物PLC應(yīng)該有所不同，其具體作用機(jī)制仍需要更多的研究揭示。

圖1 PI-PLC的結(jié)構(gòu)域分析［25］

在PLC的PH結(jié)構(gòu)域下游為EF指型結(jié)構(gòu)域，每個PLC基因含有2-4個EF指型結(jié)構(gòu)域，每個EF指型結(jié)構(gòu)域具有1個典型的螺旋-轉(zhuǎn)角-螺旋結(jié)構(gòu)，可以和鈣離子相結(jié)合。在其他含有EF指型結(jié)構(gòu)域的蛋白中，EF指型結(jié)構(gòu)域也是成對存在的，這種嚴(yán)格成對出現(xiàn)的現(xiàn)象可能與底物結(jié)合及鈣離子結(jié)合相關(guān)［17］。如果敲除EF指型結(jié)構(gòu)域可以使鈣離子依賴的PLC酶活性降低［18，19］。雖然EF指型結(jié)構(gòu)域?qū)LC活性的調(diào)控起重要作用，但是植物PLC并沒有前2個EF指型結(jié)構(gòu)域，只有2個EF指型結(jié)構(gòu)域。另外，相關(guān)研究表明，前2個EF指型結(jié)構(gòu)域能夠與鈣離子及鎂離子相結(jié)合，而后2個EF指型結(jié)構(gòu)域

卻不能［17］。但植物PLC與動物PLC相比，只有后2個EF指型結(jié)構(gòu)域，它們是否能夠與鈣離子及鎂離子結(jié)合，以及具體結(jié)合機(jī)制迄今為止還尚不清楚。

位于EF指型結(jié)構(gòu)和C2結(jié)構(gòu)域之間的X結(jié)構(gòu)域和Y結(jié)構(gòu)域是PLC結(jié)構(gòu)中最保守的兩個結(jié)構(gòu)域。這兩個結(jié)構(gòu)是由α螺旋和β折疊交互組成，類似于不完整的磷酸丙糖異構(gòu)酶的α/β barrel結(jié)構(gòu)域，是PLC的催化結(jié)構(gòu)域［20］。在X結(jié)構(gòu)域和Y結(jié)構(gòu)域之間的鏈接區(qū)域非常不保守，它與對PLC的活性調(diào)節(jié)無關(guān)，但這個區(qū)域?qū)Φ鞍姿饷甘置舾?，這說明在信號轉(zhuǎn)導(dǎo)中PLC信號的終結(jié)可能是從水解這個區(qū)域開始的［21］。在所有真核生物中PLC基因的X結(jié)構(gòu)域和Y結(jié)構(gòu)域均十分保守，它對底物的結(jié)合及催化具有重要作用。例如，在動物PLCδ1中第438位與第440位的賴氨酸、第522位的絲氨酸以及第549位的精氨酸能與底物中4位與5位的磷酸集團(tuán)相互作用。第549位的精氨酸直接控制PLC對磷脂酰肌醇（4，5）-二磷酸的水解，而該位點氨基酸突變后PLC將會水解磷脂酰肌醇［22］。雖然PLC中X結(jié)構(gòu)域和Y結(jié)構(gòu)域均十分保守，但也存在特殊情況，這就是擬南芥AtPLC8及AtPLC9。擬南芥AtPLC8及AtPLC9的Y結(jié)構(gòu)域缺失了一部分片段，這將影響PLC的水解活性。但是，在對擬南芥plc9突變體的研究中發(fā)現(xiàn)，突變體較野生型植株對熱處理尤為敏感［1］。

在所有植物PI-PLC中均包含一個C2結(jié)構(gòu)域，這個區(qū)域與磷脂及鈣離子的結(jié)合相關(guān)。在馬鈴薯水稻的PI-PLC中，C2結(jié)構(gòu)域中的疏水殘基與K-（K，R）-T-K多元區(qū)域能夠控制C2結(jié)構(gòu)域特異的與帶負(fù)電荷的磷脂相結(jié)合［23］。在一些植物中，C2結(jié)構(gòu)域調(diào)控PLC附著于細(xì)胞膜上，在缺失EF指型結(jié)構(gòu)域時C2結(jié)構(gòu)域仍能完成這項任務(wù)［24］。雖然植物中PLC的4種結(jié)構(gòu)域比較保守，但是它們各自的功能還需要進(jìn)一步的研究才能確定。

3 磷脂酶C信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑

PLC中的NPC和PI-PLC在信號轉(zhuǎn)導(dǎo)中均起著非常重要的作用。NPC可以水解磷脂生成一個分子的DAG和一個含有磷酸基團(tuán)的頭部。DAG作為重要的第二信使分子早已經(jīng)在動物研究中得非常透徹了，主要功能為激活蛋白激酶C（Protein kinase C，PKC）從而激活一系列信號傳遞級聯(lián)途徑［26-29］。近期的研究表明，擬南芥中NPC4水解生成的DAG可促使DGDG生成，但并不能產(chǎn)生PA［10，30］。最新研究結(jié)果表明NPC4突變后抑制ABA誘導(dǎo)的PA生成，說明在ABA信號系統(tǒng)中一部分PA來源于NPC4水解生成的DAG［9］，NPC是否能通過DAG調(diào)節(jié)PA的量還需要更多的實驗證實。另外，NPC水解的另一個產(chǎn)物——具有磷酸基團(tuán)的頭部可以充當(dāng)磷的供體，當(dāng)機(jī)體內(nèi)磷元素缺乏的時候會誘導(dǎo)NPC的表達(dá)與活化，生成更多的帶有磷酸基團(tuán)的產(chǎn)物，最后轉(zhuǎn)化成磷元素供給機(jī)體代謝所需［10］。

PI-PLC是典型的PLC，動植物中多數(shù)的PLC均為PI-PLC。PI-PLC可以水解PI（4，5）P2生成兩個信使分子IP3和DAG。而最近的研究結(jié)果顯示，PIPLC也可以水解PI（4）P，生成IP2和DAG［25］。早在1983年就已經(jīng)證實IP3可以促使內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中儲存的鈣離子釋放出來，此項結(jié)果發(fā)表在Nature上［31］。之后的許多對不同組織中的研究證明了這個試驗結(jié)果［32-34］。IP3也被認(rèn)為是促使鈣離子釋放的第二信使［35-37］。IP3/Ca2+信號系統(tǒng)在細(xì)胞中可以參與調(diào)控細(xì)胞的諸多生理過程。它可以直接產(chǎn)生鈣離子，也可以通過其他信號系統(tǒng)來產(chǎn)生鈣離子［38-41］。IP2和IP3在體內(nèi)可以轉(zhuǎn)化為IP6，再誘導(dǎo)鈣離子的釋放［42，43］。

作為PLC的另外一個產(chǎn)物，動物中DAG的主要作用靶蛋白就是蛋白激酶C。有報道顯示在鼠卵的精子中PKC的活性高于其他組織［28，44］。此外，小鼠中不僅具有常見的鈣離子和DAG可激活的α、β和γ類型的PKC，還具有一個新的DAG可激活的δ類型PKC以及非典型的ζ、λ類PKC，鈣離子和DAG也無法激活非典型的ζ、λ類PKC［26，29，30］，這些PKC的存在與作用可能與PLC相關(guān)。但是在植物中并不存在PKC，那么DAG是通過何種方式來發(fā)揮作用，植物中PLC水解生成的DAG可以被二脂酰甘油激酶（Diacyl glycerol kinase，DGK）磷酸化而生成PA，PA作為新興的第二信使分子已經(jīng)被證實廣泛存在于動植物的各種細(xì)胞功能之中［45-47］。植物中的DAG可以通過轉(zhuǎn)化為PA來行使其功能。

4 動植物磷脂酶C信號途徑的異同

磷脂酶C參與植物生長發(fā)育以及逆境反應(yīng)的主要方式是通過其酶解產(chǎn)物實現(xiàn)，這個結(jié)論是從動物研究中得出的，而其在植物中的具體作用方式仍不清楚。迄今為止，在植物中一直沒有發(fā)現(xiàn)PLC下游信號中的兩個重要調(diào)節(jié)因子，即IP3的受體和蛋白激酶C。現(xiàn)在眾多植物的基因組已經(jīng)完全測序，包括擬南芥、水稻、大豆、番茄和楊樹等植物。還有許多EST文庫，在這些龐大的數(shù)據(jù)庫中都未發(fā)現(xiàn)編碼IP3受體的基因［48］。但是在衣藻中發(fā)現(xiàn)了一個IP3受體，其他有纖毛的生物體如草履蟲也發(fā)現(xiàn)含有IP3受體，這說明高等植物可能在進(jìn)化過程中丟失了IP3受體。植物中丟失了IP3受體后，IP3通過何種方式起作用，IP3在動物中何以促使胞內(nèi)鈣離子的釋放，而Chlieh等［42］的研究結(jié)果表明，植物中IP3并不能直接調(diào)節(jié)胞內(nèi)鈣離子的釋放，而IP6是促進(jìn)鈣離子釋放的主要因素。植物體內(nèi)生成的IP3會被迅速磷酸化成IP6，促使鈣離子釋放［42，43］。這在一定程度上詮釋了植物中IP3受體丟失的原因，動物中IP3通過與其受體相互作用而傳遞信號；而在植物中IP3是通過進(jìn)一步磷酸化為IP6行使功能的。磷脂酶也參與了G蛋白信號途徑，動物中的Gα亞基可以與PLCβ1相結(jié)合，并增強(qiáng)PLCβ1的活性［49］。在植物中也發(fā)現(xiàn)了PLC與G蛋白互作的例子，如通過酵母雙雜交試驗證明了豆科植物中的PsPLC可以與PsGα1相互作用，免疫共沉淀試驗也證明了這一點，PsPLC與G蛋白相互作用后調(diào)節(jié)植物對鹽及熱的耐受能力［50］。

在植物中不僅沒有發(fā)現(xiàn)IP3受體，而且也沒有發(fā)現(xiàn)DAG能夠激活的蛋白激酶C［25］。在動物中，PKC作為DAG的重要靶點，可以激活轉(zhuǎn)錄因子NFKappaB（Nuclear factor-KappaB），NF-KappaB在腫瘤發(fā)生的調(diào)控過程中起重要作用［51］。在植物中卻沒有蛋白激酶C，植物中PLC水解產(chǎn)生的DAG是通過何種途徑參與信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的，Ruelland等［52］發(fā)現(xiàn)在鹽、低溫、微生物病害以及高滲脅迫時植物中的DAG可以被二酰甘油激酶（DAG kinase，DGK）磷酸化生成磷脂酸，磷脂酸可以調(diào)節(jié)植物對逆境進(jìn)行應(yīng)答，并作出抵抗反應(yīng)（圖2）［25］。但是，人們暫時無法確認(rèn)DGK磷酸化的DAG是來源于PLC還是其他磷脂酶的水解產(chǎn)物，所以仍需要進(jìn)一步試驗證實這個推測。

圖2 動植物磷脂酶C信號通路之間的異同［25］

5 磷脂酶C與磷脂酰肌醇信號系統(tǒng)

磷脂酰肌醇信號轉(zhuǎn)導(dǎo)中存在諸多酶類，其中主要分為兩類：一類為包括PLA、PLC和PLD的水解酶；另一類為包括的磷脂酰肌醇一磷酸4激酶（Phosphoinositide phosphate 4-kinase，PIP4K）、磷 脂 酰 肌 醇 一 磷 酸5激 酶（Phosphoinositide phosphate 5-kinase，PIP5K）和磷脂酰肌醇4激酶（Phosphoinositide 4-kinase，PI4K）等的磷酸酶［53］。在擬南芥中已經(jīng)證實了12個PI4K［54］、15個PIP5K［53］、12個PLD［55］和9個PLC［13，54］。水稻中也含有10個PIP5K、11個PI4K［53］、17個PLD［56］和4個PLC［13］。這些酶所參與的磷脂信號在諸多生理過程中起著重要作用。

在鹽脅迫下擬南芥中的PIP2含量會迅速上升，說明PIP2在植物鹽脅迫中起重要作用［57］。PIP2及其被水解生成的IP3在鹽、干旱和低溫脅迫下均能夠迅速積累，而sac9（Suppressor of actin，SAC）突變體卻可以明顯抑制這種積累［58］。SAC9的缺失嚴(yán)重抑制了植株的正常生長。最新研究結(jié)果顯示，鹽處理誘導(dǎo)披網(wǎng)格蛋白小泡（Clathrin-coated vesicles）中的PIP2的積累和PI3K調(diào)控的胞吞作用對植物對鹽脅迫的適應(yīng)是很重要的［59，60］，這些也說明了在鹽脅迫中細(xì)胞內(nèi)囊泡運(yùn)輸?shù)闹匾?。磷脂酰肌醇生物合成體系中的各個成分均在不同生理過程中起調(diào)控作用，其中又以PIP2的作用較為重要，所以對PI4K和PLC的研究顯得尤為重要。

6 展望

近年來，隨著植物生理學(xué)與植物分子生物學(xué)研究的深入，人們發(fā)現(xiàn)植物磷脂酶C基因在植物逆境信號轉(zhuǎn)導(dǎo)中起著重要作用。然而，對于其功能的研究主要集中于其水解產(chǎn)生的兩個第二信使分子（IP3與DAG），但到目前為止仍沒有直接證據(jù)表明由PLC水解生成的IP3/DAG與下游信號分子PA/Ca2+之間具有直接聯(lián)系。Ca2+與PA均是重要的植物第二信使分子，它們能夠調(diào)節(jié)植物生長發(fā)育以及植物抗逆性等多種生理過程。植物PLC參與的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)網(wǎng)絡(luò)較為復(fù)雜，并且下游靶分子的鑒定仍缺少證據(jù)，但是人們越來越重視對PLC的研究工作。目前，PLC基因的結(jié)構(gòu)以及在植物逆境脅迫下的作用已經(jīng)得到了初步的證實。后續(xù)研究將主要針對PLC是否可以通過DAG/PA調(diào)節(jié)Ca2+與PA，以及在不同逆境脅迫中PLC對生成Ca2+與PA的貢獻(xiàn)率問題。對PLC基因功能的深入研究將進(jìn)一步揭示植物生長發(fā)育以及抵抗不同外源脅迫后的生理反應(yīng)，一方面能夠填補(bǔ)PLC基因在這個領(lǐng)域的空白，另外也能夠為利用基因工程手段改良植物抗逆性提供優(yōu)質(zhì)候選基因。

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（責(zé)任編輯 狄艷紅）

Advance in the Research of Phospholipase C Gene Family

Wang Fawei1Wang Qi3Deng Yu1，2Dong Jinye2Wan Nan1Li Xiaowei1Li Haiyan1
（1. Ministry of Education Engineering Research Center of Bioreactor and Pharmaceutical Development，Jilin Agricultural University，Changchun 130118；2. College of Life Science，Jilin Agricultural University，Changchun 130118；3. High School attached to Northeast Normal University，Changchun 130021）

Phospholipase C（PLC）is a key member from phospholipase family, it cleaves phosphatidylinositol 4, 5-bisphosphate（PIP2）into diacylglycerol（DAG）and inositol 1, 4, 5-trisphosphate（IP3）. In animals, PLCs are recognized as key components of signals through specific targets, such as protein kinase C or Ca2+-dependentsignaling networks. In plants, PLCs were characterized to regulate several abiotic and biotic stresses, but the mechanism of it are still unknown. In this review, we focused on the classification, structure, and the functions in different signal transduction.

PLC gene Inositol trisphosphate Diacylglycerol Structure Signal transduction

10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2014.12.006

2014-04-25

國家自然科學(xué)基金項目（31201144，31271746），教育部高等學(xué)校博士學(xué)科點專項科研基金（20122223120003），吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)國家大學(xué)生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓(xùn)練計劃項目（201410193036）

王法微，男，助理研究員，碩士生導(dǎo)師，研究方向：植物分子生物學(xué)；E-mail：fw-1980@163.com

李海燕，女，教授，博士生導(dǎo)師，研究方向：植物分子生物學(xué)；E-mail：hyli99@163.com