宋芳芳 姜禮紅 么曉軼 孟松艷

胰島素樣生長(zhǎng)因子?1對(duì)APP／PS1雙轉(zhuǎn)基因小鼠腦內(nèi)Aβ1?40沉積的影響

宋芳芳 姜禮紅 么曉軼 孟松艷

目的以SPF級(jí)APP／PS1雙轉(zhuǎn)基因小鼠（22周）為阿爾茨海默病（AD）動(dòng)物模型，皮下注射胰島素樣生長(zhǎng)因子?1（IGF?1），觀察其對(duì)AD模型小鼠腦內(nèi)淀粉樣蛋白（Aβ1?40）表達(dá)的影響。方法將APP／PS1雙轉(zhuǎn)基因小鼠及隱性基因小鼠分為4組，設(shè)立隱性基因組、隱性基因治療組、轉(zhuǎn)基因組及轉(zhuǎn)基因治療組。隱性基因治療組、轉(zhuǎn)基因治療組分別皮下注射IGF?1［50μg／（kg·d）］，共8周。隨后，各組行免疫組化方法觀察小鼠腦內(nèi)Aβ1?40的表達(dá)。結(jié)果轉(zhuǎn)基因組及轉(zhuǎn)基因治療組可見(jiàn)神經(jīng)元缺失。同轉(zhuǎn)基因組比較，無(wú)論是皮質(zhì)區(qū)還是海馬區(qū)，轉(zhuǎn)基因治療組腦內(nèi)Aβ1?40的表達(dá)均明顯減少（P＜0.05）。結(jié)論IGF?1有降低APP／PS1雙轉(zhuǎn)基因小鼠腦內(nèi)Aβ1?40表達(dá)的作用，具有阻斷和延緩AD模型腦內(nèi)老年斑形成的作用，尤其是對(duì)皮質(zhì)區(qū)的Aβ1?40表達(dá)的阻斷更為明顯。

淀粉樣蛋白；阿爾茨海默?。灰葝u素樣生長(zhǎng)因子?1；APP／PS1雙轉(zhuǎn)基因小鼠

阿爾茨海默?。ˋD）是中樞神經(jīng)系統(tǒng)進(jìn)行性變性疾病，腦神經(jīng)細(xì)胞之間形成老年斑是其重要的病理特征。老年斑的主要成分是Aβ的沉積，能對(duì)細(xì)胞造成毒性損害，是導(dǎo)致患者腦功能障礙的主要原因。

胰島素樣生長(zhǎng)因子?1（insulin?like growth factor，IGF?1）結(jié)構(gòu)類似胰島素，具有刺激多種細(xì)胞增殖、分化、遷移、存活、代謝等的作用?？烧{(diào)節(jié)神經(jīng)細(xì)胞的生長(zhǎng)和分化，對(duì)維持腦的正常功能起著重要作用。IGF?1可抑制細(xì)胞凋亡，有助于神經(jīng)細(xì)胞受損后的功能恢復(fù)，現(xiàn)已被確認(rèn)為一種神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子，在神經(jīng)系統(tǒng)有重要的營(yíng)養(yǎng)保護(hù)作用。IGF?1可通過(guò)血腦屏障進(jìn)入中樞神經(jīng)系統(tǒng)，通過(guò)脈絡(luò)叢的上皮細(xì)胞或轉(zhuǎn)運(yùn)體調(diào)節(jié)進(jìn)入中樞神經(jīng)系統(tǒng)的含量［1］。本實(shí)驗(yàn)利用APP／PS1雙轉(zhuǎn)基因小鼠模型，皮下注射IGF?1作為早期干預(yù)治療，對(duì)皮質(zhì)區(qū)Aβ1?40表達(dá)進(jìn)行了觀察，探討IGF?1對(duì)AD的保護(hù)作用。

1 材料和方法

1.1 主要試劑 重組人IGF?1（Prospec公司），抗Aβ1?40多克隆抗體（Abcam公司提供）。

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物和分組 SPF級(jí)APP／PS1雙轉(zhuǎn)基因小鼠及隱性基因小鼠各16只（南京大學(xué)模式動(dòng)物研究所提供），雌雄各半，22周齡，體質(zhì)量（32±6）g，分籠飼養(yǎng)，每籠1只，室內(nèi)常溫下配方飼料喂養(yǎng)，自由飲食水。將小鼠隨機(jī)分為4組，隱性基因組、隱性基因治療組、轉(zhuǎn)基因組、轉(zhuǎn)基因治療組，每組8只。隱性基因組及轉(zhuǎn)基因組：不進(jìn)行任何處置；隱性基因治療組及轉(zhuǎn)基因治療組：腹部皮下注射IGF?1［50μg／（kg·d）］，用藥8周。

1.3 免疫組織化學(xué) 用10%水合氯醛麻醉小鼠，打開(kāi)胸腔，經(jīng)升主動(dòng)脈快速灌注生理鹽水，直至右心房流出液清亮為止。然后用4%多聚甲醛灌注固定，斷頭取腦。投入4%多聚甲醛溶液中固定，做冠狀切面，固定、石蠟包埋、切片、脫蠟、水化，3%H2O2室溫10 min滅活內(nèi)源性酶，蒸餾水洗滌3次，滴加正常血清封閉液，室溫20 min，甩去余液，不同的切片分別加入Aβ1?40抗體（一抗稀釋濃度均為1∶2000），4℃濕盒內(nèi)過(guò)夜。滴加山羊抗兔IgG抗體?HRP多聚體，37℃20 min，PBS洗3次，每次3 min，用DAB顯色，常規(guī)脫水、透明、封片。

1.4 計(jì)數(shù)方法與統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 以神經(jīng)細(xì)胞膜或胞漿出現(xiàn)棕黃色顆粒沉著為陽(yáng)性結(jié)果。每組取8張腦片，每張切片皮質(zhì)區(qū)及海馬區(qū)分別取10個(gè)高倍視野，計(jì)數(shù)每個(gè)視野Aβ1?40免疫組化陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)，取其均值。所有數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（s）表示，全部數(shù)據(jù)采用SPSS 19.0軟件分析，組間均數(shù)比較用單因素方差分析，兩兩比較用LSD法，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 Aβ1?40免疫陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)比較 隱性基因組皮質(zhì)區(qū)與海馬區(qū)Aβ1?40免疫陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)存在差異（P＝0.01），IGF?1治療對(duì)隱性基因小鼠Aβ1?40沉積作用不明顯（P＝0.388）。皮質(zhì)區(qū)隱性基因組和隱性基因治療組Aβ1?40免疫陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＝0.677），海馬區(qū)隱性基因組和隱性基因治療組Aβ1?40免疫陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＝0.419）。

轉(zhuǎn)基因組皮質(zhì)區(qū)與海馬區(qū)Aβ1?40沉積存在統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＝0.002），皮質(zhì)區(qū)Aβ1?40免疫陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)相對(duì)較多；同轉(zhuǎn)基因組比較，無(wú)論是皮質(zhì)區(qū)還是海馬區(qū)，轉(zhuǎn)基因治療組Aβ1?40免疫陽(yáng)性神經(jīng)元均有所減少；IGF?1對(duì)兩區(qū)域治療效果也存在差異（P＜0.01）。見(jiàn)表1。

2.2 鏡下觀察 轉(zhuǎn)基因組及轉(zhuǎn)基因治療組可見(jiàn)部分神經(jīng)元缺失，細(xì)胞排列疏松紊亂，老年斑形成，可見(jiàn)大量棕褐色陽(yáng)性細(xì)胞，胞質(zhì)及軸突、樹(shù)突均清晰著色，轉(zhuǎn)基因治療組老年斑相對(duì)較少；隱性基因組及隱性基因治療組海馬區(qū)偶見(jiàn)Aβ1?40免疫陽(yáng)性神經(jīng)元。見(jiàn)圖1～8。

表1 各組Aβ1?40免疫陽(yáng)性神經(jīng)元數(shù)值比較（陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)／100個(gè)細(xì)胞，s，n＝8）

表1 各組Aβ1?40免疫陽(yáng)性神經(jīng)元數(shù)值比較（陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)／100個(gè)細(xì)胞，s，n＝8）

注：與皮質(zhì)區(qū)比較，??P＜0.01；與轉(zhuǎn)基因組比較，△△P＜0.01

組別皮質(zhì)區(qū)海馬區(qū)隱性基因組5.64±1.07 4.11±0.94??轉(zhuǎn)基因組58.31±6.48 48.05±9.50??隱性治療組5.39±1.33 3.63±1.37??轉(zhuǎn)基因治療組46.31±5.16 38.83±6.99??△△

圖1 隱性基因組皮質(zhì)區(qū)Aβ1?40表達(dá)（×20）

圖2 轉(zhuǎn)基因組皮質(zhì)區(qū)Aβ1?40表達(dá)（×20）

3 討論

多項(xiàng)實(shí)驗(yàn)提示IGF?1在老年性癡呆的治療中可能具有一定的臨床價(jià)值，IGF?1及其受體能調(diào)節(jié)乙酰膽堿的合成與釋放［2］，抑制蛋白的高度磷酸化［3］，可改善老齡動(dòng)物的記憶、學(xué)習(xí)能力［4］，從而揭示了IGF?1影響認(rèn)知功能的可能機(jī)制。相反，給予IGF?1抗體的大鼠學(xué)習(xí)記憶能力顯著下降［5］。這些發(fā)現(xiàn)使IGF?1信號(hào)系統(tǒng)在AD發(fā)病機(jī)制中的作用研究迅速擴(kuò)展開(kāi)來(lái)。目前對(duì)于IGF?1在AD中的作用有了一定的認(rèn)識(shí)，但結(jié)論尚未統(tǒng)一。本實(shí)驗(yàn)采用APP／PS1雙轉(zhuǎn)基因小鼠為AD動(dòng)物模型，該品系小鼠在出生后4月齡時(shí)就可觀察到老年斑形成，隨著月齡增長(zhǎng)，腦內(nèi)老年斑堆積增加，逐漸出現(xiàn)認(rèn)知功能障礙，因此選擇該動(dòng)物模型，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)不易受人為因素的影響。選擇對(duì)轉(zhuǎn)基因鼠進(jìn)行早期干預(yù)治療，以探討IGF?1對(duì)Aβ早期生成、凝聚過(guò)程的作用機(jī)制。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，7月齡APP／PS1雙轉(zhuǎn)基因小鼠皮質(zhì)區(qū)出現(xiàn)部分神經(jīng)元缺失，細(xì)胞排列疏松紊亂，可見(jiàn)大量棕褐色Aβ1?40陽(yáng)性細(xì)胞，有老年斑形成，海馬區(qū)顆粒細(xì)胞帶輕度受損，神經(jīng)元排列尚規(guī)則。應(yīng)用IGF?1治療后，與轉(zhuǎn)基因組比較，轉(zhuǎn)基因治療組小鼠腦內(nèi)Aβ1?40水平明顯降低，老年斑形成減少，表明IGF?1能降低APP／PS1雙轉(zhuǎn)基因小鼠腦內(nèi)Aβ1?40的表達(dá)，具有阻斷和延緩AD模型腦內(nèi)老年斑形成的作用。據(jù)此推論，IGF?1皮下

注射，使APP／PS1雙轉(zhuǎn)基因小鼠Aβ1?40表達(dá)減少，可能是延緩AD病程進(jìn)展、改善AD認(rèn)知功能的機(jī)制之一，早期的IGF?1干預(yù)治療可能對(duì)延緩AD病程進(jìn)展更行之有效。IGF?1對(duì)APP／PS1雙轉(zhuǎn)基因小鼠皮質(zhì)區(qū)及海馬區(qū)Aβ1?40表達(dá)的作用也存在差別，尤其是對(duì)皮質(zhì)區(qū)的Aβ1?40表達(dá)的阻斷更為明顯，這可能與不同區(qū)域IGF?1的敏感程度不同有關(guān)。實(shí)驗(yàn)用藥時(shí)間共8周，更長(zhǎng)時(shí)間的IGF?1藥物治療對(duì)Aβ1?40表達(dá)的作用及對(duì)老年斑形成的影響，還需要更進(jìn)一步的研究。盡管IGF?1真正應(yīng)用于臨床治療AD還需要克服很多難題，相信將來(lái)IGF?1可能成為治療AD的新途徑。

圖3 隱性基因治療組皮質(zhì)區(qū)Aβ1?40表達(dá)（×20）

圖4 轉(zhuǎn)基因治療組皮質(zhì)區(qū)Aβ1?40表達(dá)（×20）

圖5 隱性基因組海馬區(qū)Aβ1?40表達(dá)（×20）

圖6 轉(zhuǎn)基因組海馬區(qū)Aβ1?40表達(dá)（×20）

圖7 隱性基因治療組海馬區(qū)Aβ1?40表達(dá)（×20）

圖8 轉(zhuǎn)基因治療組海馬區(qū)Aβ1?40表達(dá)（×20）

IGF?1與中樞神經(jīng)系統(tǒng)的關(guān)系存在兩面性。一方面它作為神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子具有延緩AD的作用［6?7］，但另一些實(shí)驗(yàn)結(jié)果則恰恰相反，特別是針對(duì)Aβ代謝和毒性的研究中［8?9］。所以目前關(guān)于IGF?1與AD關(guān)系尚沒(méi)有定論，也正因?yàn)槿绱?，值得更多和更?xì)致的研究。

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Effects of insulin?like grow th factor?1 on reducing over?expression of Aβ1?40in the brain of APP／PS1 double trans?genic mouse

SONG Fang?fang，JIANGLi?hong，YAO Xiao?yi，MENGSong?yan．DepartmentofGeriatrics，the Second Af?filiated Hospital ofHarbin Medical University，Harbin 150086，China

ObjectiveTo investigate the effects of subcutaneous injection of insulin like growth factor?1（IGF?1）on the expression of amyloid protein（Aβ1?40）in the APP／PS1 double transgenic mice.MethodsAPP／PS1 double trans?genicmice and recessivemicewere respectively divided into 4 groups，the establishmentof recessive genome group，reces?sive gene therapy group，genome group and transgenic therapy group.Subcutaneous injection of IGF?1［50μg／（kg·d）］were given to both the recessive gene therapy group and transgenic therapy group.After 8 weeks，the expression of the Aβ1?40in the cortical area and hippocampal area ofmouse was detected by immunohistochemicalmethods.ResultsThe genome group and transgenic therapy group also exhibited irregular arrangement of neuron units.The expression of Aβ1?40in the cortical and hippocampal area in the transgenic therapy group was significantly lower than that in genome group（P＜0.05）.ConclusionsThrough decreasing the expression of Aβ1?40in the cortical and hippocampal area，IGF?1might in?hibit the damage induced by Aβ1?40in the AD micemodel.

amyloid protein；Alzheimer's disease；insulin like growth factor?1；APP／PS1 double transgenicmouse

R 749.16 ［

］ A

10.3969／j.issn.1003?9198.2014.11.009

2014?01?14）

黑龍江省留學(xué)歸國(guó)科學(xué)基金項(xiàng)目（LC2009C13）

150086黑龍江省哈爾濱市，哈爾濱醫(yī)科大學(xué)第二附屬醫(yī)院第四住院部干部五病房

姜禮紅，Email：1551482485＠qq.com