王東凱，任雪姣，盧丹丹，任雷鳴

(1.河北醫(yī)科大學中西醫(yī)結合學院，河北石家莊 050017；2.河北醫(yī)科大學第四醫(yī)院，河北石家莊 050011)

牽拉對毒蕈堿受體和5-羥色胺受體介導大鼠離體胃平滑肌收縮功能的影響

王東凱1?，任雪姣2?，盧丹丹1，任雷鳴1

(1.河北醫(yī)科大學中西醫(yī)結合學院，河北石家莊 050017；2.河北醫(yī)科大學第四醫(yī)院，河北石家莊 050011)

目的 研究牽拉對毒蕈堿(M)受體及5-羥色胺(5-HT)受體介導大鼠離體胃平滑肌收縮功能的影響。方法 大鼠離體胃底、胃體、胃竇、賁門和幽門環(huán)行肌標本分別給予1.0,1.5,2.0,2.5和3.0 g的前負荷,除胃竇環(huán)肌給予單濃度卡巴膽堿(CCh)(0.3 μmol·L－1)外,其余標本采用累積給藥法給予CCh 0.001～30 μmol·L－1,5-HT 0.0001～30 μmol·L－1,記錄收縮反應。結果 大鼠胃底、胃體和幽門環(huán)肌在1.0 g前負荷下,CCh誘發(fā)收縮反應的－Log EC50值最大,－Log EC50值隨前負荷升高而顯著減小(P＜0.05,P＜0.01)；5-HT誘發(fā)胃底環(huán)行肌收縮反應結果類似。與1.0 g前負荷相比,3.0 g前負荷時CCh和5-HT誘發(fā)賁門環(huán)肌收縮反應的 Emax值分別增大117.4%和75.7%；5-HT誘發(fā)胃體環(huán)肌收縮反應的 Emax值亦增大115.9%。CCh誘發(fā)各環(huán)行肌收縮的Emax值(g)分別為:賁門10.453±2.956(3.0 g前負荷)、胃底13.878± 2.618(2.5 g前負荷)、胃體10.244±1.843(2.5 g前負荷)、幽門2.585±1.098(2.5 g前負荷)。5-HT誘發(fā)各環(huán)肌收縮的Emax值(g)分別為:賁門4.363±1.705(3.0 g前負荷)、胃底3.931±0.615(3.0 g前負荷)、胃體3.161±0.680(3.0 g前負荷)。結論 0.5 g或1.0 g前負荷不適于研究M受體和5-HT受體介導的大鼠離體賁門、胃底、胃體和幽門環(huán)肌的收縮反應,2.0 g前負荷可能是研究M受體和5-HT受體介導大鼠離體胃環(huán)肌收縮反應的理想條件。

受體,毒蕈堿；受體,5-羥色胺；牽拉；胃體；胃底；賁門；幽門

胃平滑肌條是醫(yī)學研究中的常用實驗標本，受體激動劑誘發(fā)收縮反應的半數(shù)有效量(EC50)和最大反應(Emax)是2個關鍵參數(shù)。國內文獻報道，大鼠離體胃平滑肌條常施予1.0 g前負荷[1－3]；國外文獻中，前負荷差異較大，0.5 g[4]，1.0 g[5－8]和2.0 g[9－10]均有報道，但未注明前負荷選擇的理由。國外曾有報道，不同前負荷能影響人支氣管平滑肌[11]和犬冠狀動脈平滑肌[12]標本的收縮效能；Ren等[13]報道，在兔離體血管環(huán)肌標本，不同程度牽拉對α1受體介導收縮的EC50值有顯著影響，推測不同前負荷對不同受體介導平滑肌收縮的影響不同。

哺乳動物大約95%的5-羥色胺(5-hydroxy-tryptamine，5-HT)存在于胃腸道[14]；5-HT1A和5-HT1D受體激動劑可調節(jié)胃動力。舒馬曲坦激活5-HT1B/1D受體，對功能性消化不良患者可松弛胃底(延遲胃排空)，改善胃的順應性，減輕胃脹和早飽感[15]。乙酰膽堿(acetylcholine，ACh)是副交感神經的遞質，能激動各類膽堿受體，興奮胃腸平滑肌。

本研究以卡巴膽堿(carbachol，CCh)和5-HT作為胃平滑肌收縮劑，分析不同牽拉程度對M受體和5-HT受體介導收縮的影響，各激動劑產生收縮時藥物EC50值和Emax值的變化規(guī)律。

1 材料與方法

1.1 藥品、實驗動物和儀器

CCh購自德國ABCR GmbH＆Co KG公司，5-HT購自日本Kasei Kogyo Co Ltd公司。K-H液成分(mmol·L－1):NaCl 133、KCl 4.7、MgSO40.61、NaH2PO41.35、CaCl22.52、NaHCO316.3、葡萄糖7.8，pH 7.2，均購自美國Sigma公司。30只健康雄性Wistar大鼠，體質量 250～300 g，許可證號SCXK(冀)2013-1-003，由河北省實驗動物中心提供。PowerLab 8/35型數(shù)據(jù)采集系統(tǒng)(包括Octal Bridge Amp、張力換能器)由澳大利亞AD Instruments Pty Ltd生產；CP213型電子天平是美國Ohaus Corporation公司產品。

1.2 離體胃平滑肌標本的制備

大鼠禁食不禁水12 h，烏拉坦1.5 g·kg－1皮下注射麻醉后頸動脈放血處死，取全胃。沿胃大彎剪開，以95%O2＋5%CO2、4℃改良K-H液中漂洗干凈，沿環(huán)肌方向切取腹側胃底、胃體、胃竇、賁門和幽門環(huán)肌5個部位[16－17]。每只大鼠取胃底環(huán)肌2條、胃體環(huán)肌2條以及胃竇、賁門和幽門環(huán)肌各1條，分別長約2 mm×8 mm，去除黏膜。標本一端固定于支架上，另一端接張力換能器，置于(37±0.5)℃的K-H液浴槽中。

胃底、胃體、胃竇、賁門和幽門環(huán)肌分別給予1.0，1.5，2.0，2.5和3.0 g的前負荷。在各自前負荷下平衡1 h(每15 min換1次K-H液)后開始實驗。胃底、胃體、賁門和幽門環(huán)肌采用累積給藥法給予CCh(0.001～30 μmol·L－1)；5種標本均累積給予 5-HT(0.0001～30 μmol·L－1)。預實驗顯示，＜0.3 μmol·L－1時，胃竇環(huán)肌的節(jié)律性收縮與強直性收縮區(qū)分不明顯，難以分析數(shù)據(jù)；＞0.3 μmol·L－1時，收縮的節(jié)律紊亂。故胃竇環(huán)肌采用單濃度(0.3 μmol·L－1)給藥法[18]。每個標本依次在5個前負荷下完成一種藥物的5次量效曲線，張力換能器記錄收縮反應(g)。

1.3 統(tǒng)計學分析

2 結果

2.1 牽拉對CCh誘發(fā)胃平滑肌收縮的影響

CCh 0.001～30 μmol·L－1可使大鼠離體賁門、胃底、胃體和幽門環(huán)肌產生濃度依賴性收縮反應。雙因素方差分析顯示，賁門、胃底和胃體環(huán)肌在1.5，2.0，2.5和3.0 g前負荷下，CCh誘發(fā)的收縮顯著大于1.0 g的收縮(P＜0.05，P＜0.01；圖1A～C)。但是幽門環(huán)肌在1.0，1.5，2.0，2.5和3.0 g前負荷下，CCh誘發(fā)的收縮無統(tǒng)計學差異(圖1D)。圖2結果顯示，單濃度給予CCh 0.3 μmol·L－1時，胃竇環(huán)肌在1.0，1.5，2.0，2.5和3.0 g前負荷下，CCh誘發(fā)的胃竇環(huán)肌強直性收縮的振幅隨前負荷增加而下降，但無統(tǒng)計學差異(圖2A)。CCh誘發(fā)的胃竇節(jié)律性收縮振幅隨前負荷的增加而增強，前負荷2.0 g時收縮振幅顯著強于1.0 g(P＜0.01，圖2B)；前負荷2.5 g和3.0 g時收縮振幅與2.0 g相似(圖2B)。胃竇環(huán)肌收縮頻率與前負荷(1.0 g～3.0 g)呈明顯的負相關(圖2C)，由1.0 g時的5.5 min－1降至3.0 g時的1.4 min－1(P＜0.01)；胃竇環(huán)肌首先呈強直性收縮，繼而為長時程節(jié)律性收縮(圖2D)。

2.2 牽拉對5-HT誘發(fā)胃平滑肌收縮的影響

5-HT 0.0001～30 μmol·L－1可使大鼠離體賁門、胃底和胃體環(huán)肌產生濃度依賴性收縮。雙因素方差分析顯示，賁門、胃底和胃體環(huán)肌在2.0，2.5和3.0 g前負荷下，5-HT誘發(fā)的收縮顯著大于1.0 g時收縮(P＜0.05，P＜0.01；圖3A～C)。5-HT對胃竇和幽門環(huán)肌無明顯作用(數(shù)據(jù)略，n＝8)。

Fig.1 Contractile responses to carbachol(0.001－30 μmol·L－1)in isolated circular muscle strips of rat gastric cardia(A，n＝9)，fundus(B，n＝20)，gastric body(C，n＝18)and pylorus(D，n＝10)under different preloads of 1.0，1.5，2.0，2.5 and 3.0 g..?P＜0.05，??P＜0.01 compared with preload 1.0 g.

Fig.2 Responses to carbachol 0.3 μmol·L－1in isolated circular muscle strips of rat gastric antrum.A:stiffnass amplitude；B:rhythmamplitude；C:rhythm frequency.，n＝6.?P＜0.05，??P＜0.01 compared with preload 1.0 g.

Fig.3 Contractile responses to 5-hydroxytryptamine(5-HT，0.0001－30 μmol·L－1)in isolated circular muscle strips of the rat gastric cardia(A，n＝12)，fundus(B，n＝7)and gastric body(C，n＝7)under different preloads of 1.0，1.5，2.0，2.5 and 3.0 g..?P＜0.05，??P＜0.01，compared with preload 1.0 g.

2.3 牽拉對CCh和5-HT誘發(fā)最大收縮和EC50的影響

單因素方差分析顯示(表1)，賁門、胃底和胃體環(huán)肌在1.0～3.0 g前負荷下，CCh誘發(fā)的最大收縮反應(Emax)隨著牽拉強度增大而升高；幽門環(huán)肌則無顯著改變。4種環(huán)肌的實測Emax值(CCh)分別為:賁門10.453±2.956(3.0 g)、胃底13.878±2.618 (2.5 g)、胃體10.244±1.843(2.5 g)和幽門2.585± 1.098(2.5 g)。賁門、胃底和胃體環(huán)肌對5-HT的反應類似于CCh，但是其Emax值明顯小于CCh；3種標本的實測Emax值(5-HT)分別為:賁門4.363±1.705 (3.0 g)、胃底3.931±0.615(3.0 g)和胃體3.161± 0.680(3.0 g)。以2.5 g的Emax值作為對照進行統(tǒng)計學分析顯示，2.0 g和3.0 g前負荷下CCh和5-HT的Emax值無顯著差異。

單因素方差分析結果顯示(表2)，在 1.0～3.0 g前負荷下，CCh和5-HT誘發(fā)賁門收縮的EC50值無顯著改變，5-HT誘發(fā)胃體環(huán)肌收縮的EC50值亦無顯著改變。在1.0 g前負荷下，CCh和5-HT誘發(fā)胃底環(huán)肌收縮的－Log EC50(mol·L－1)值分別為6.610±0.237和7.133±0.239；CCh誘發(fā)胃體和幽門環(huán)肌收縮的－Log EC50(mol·L－1)值分別為6.544±0.148和6.689±0.466。前負荷增至1.5，2.0，2.5和3.0 g時，各自的－Log EC50(mol·L－1)值逐漸變小(P＜0.05，P＜0.01)。以 2.5 g的－Log EC50值作為對照進行統(tǒng)計學分析結果顯示，2.0 g和3.0 g前負荷下CCh和5-HT的－Log EC50值無顯著差異。

Tab.1 Emaxof carbachol and 5-HT in various circular muscle strips of rats

Tab.2 －Log EC50of carbachol and 5-HT in various circular muscle strips of rats

3 討論

本研究顯示，0.5 g或1.0 g前負荷不適于研究M受體和5-HT受體介導的大鼠離體賁門、胃底、胃體和幽門環(huán)肌收縮。本課題組曾報道，在兔離體血管環(huán)標本，不同程度的牽拉(前負荷變化)對α1受體介導收縮的EC50和Emax產生顯著影響[13]；本研究在大鼠離體胃組織中多個部位的環(huán)行肌條上，證實了不同牽拉程度對不同受體介導的平滑肌收縮的影響是不同的。

本研究發(fā)現(xiàn)，在1.0～3.0 g(含3.0 g)前負荷時CCh和5-HT誘發(fā)賁門環(huán)肌收縮、5-HT誘發(fā)胃體環(huán)肌收縮的EC50值均無改變。但是與1.0 g前負荷相比，3.0 g前負荷時CCh和5-HT誘發(fā)賁門肌收縮的Emax值分別增大117.4%和75.7%，5-HT誘發(fā)胃體肌收縮的Emax值亦增大115.9%。除胃竇外，與2.5和3.0 g時相比，其他4部位標本施以2.0 g前負荷時，其EC50值和Emax值均無統(tǒng)計學差異。但是，這4部位標本的前負荷低于2.0 g時，多數(shù)標本的Emax值顯著降低。因此，推薦在2.0 g前負荷作用下，進行M受體和5-HT受體介導的大鼠離體胃平滑肌收縮的研究。鑒于這些標本在1.0 g和1.5 g前負荷下，藥物誘發(fā)收縮反應的Emax值有較大變化并有統(tǒng)計學意義，因此，選擇≤1.0 g的前負荷進行實驗顯然不合適。

M受體包含5種亞型，M1，M2和M3分布在胃腸道，M2和M3可介導大鼠胃平滑肌收縮，M3作用為主[19－20]。研究發(fā)現(xiàn)，大鼠胃底縱肌在1.0 g前負荷作用下，M2和 M3均可介導收縮，M3為主[21]。M2受體基因敲除小鼠的胃底和胃竇環(huán)肌在0.5 g前負荷下，CCh誘發(fā)收縮的EC50值明顯大于野生型小鼠，而收縮的Emax值不變；對于M3受體基因敲除小鼠相同部位，CCh誘發(fā)收縮的Emax值降低約50%，EC50值則無明顯改變；M2和M3受體基因同時敲除，CCh不再誘發(fā)收縮[22]。So等[23]報道，利用膜片鉗技術和單細胞RT-PCR技術發(fā)現(xiàn)，豚鼠胃竇平滑肌表達M1～M5受體的mRNA，但能被乙酰膽堿激活的只有M2，M3和M4受體。本研究發(fā)現(xiàn)，大鼠離體賁門、胃底、胃體和幽門環(huán)肌在前負荷相同時(1.0 g，1.5 g或 2.0 g)，CCh誘發(fā)收縮的－Log EC50值(即 pD2值)均十分接近，提示上述4個部位胃組織中介導CCh誘發(fā)收縮的M受體可能相似。然而，在5-HT誘發(fā)大鼠賁門、胃底和胃體環(huán)肌收縮中，前負荷為1.0 g時的－Log EC50值依次為6.056±0.438，7.133±0.239和6.840±0.316，賁門與胃底環(huán)肌的－Log EC50的比值為11.9。前負荷增加至1.5 g，2.0 g或2.5 g時，賁門與胃底或胃體環(huán)肌相比，5-HT的－Log EC50值有明顯差異；結果提示，介導賁門環(huán)肌收縮的5-HT受體亞型與胃底胃體不同。進一步確定大鼠賁門、胃底、胃體和幽門環(huán)肌中，介導CCh和5-HT收縮的受體亞型十分重要。

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Effect of stretch on muscarinic receptor-and 5-hydroxytryptamine receptor-mediated contractile responses in isolated gastric smooth muscle of rats

WANG Dong-kai1?，REN Xue-Jiao2?，LU Dan-dan1，REN Lei-ming1
(1.College of Chinese Integrative Medicine，Hebei Medical University，Shijiazhuang 050017，China；2.the Fourth Hospital，Hebei Medical University，Shijiazhuang 050011，China)

OBJECTlVE To investigate the effect of stretch on muscarinic receptor-and 5-hydroxytryptamine(5-HT)receptor-mediated contractile responses in isolated circular muscle strips taken from the rat stomach.METHODS The contractile responses to carbachol(CCh)0.001－30 μmol·L－1or 5-HT 0.0001－30 μmol·L－1administered cumulatively were recorded in isolated circular muscle strips taken from the gastric fundus，body，cardia and pylorus of rats under different preloads of 1.0，1.5，2.0，2.5 and 3.0 g，but a single concentration of CCh 0.3 μmol·L－1was administered to the antrum. RESULTS The－Log EC50value for CCh in the isolated circular muscle strips of the gastric fundus，body and pylorus under 1.0 g preload was the largest，but decreased significantly with higher preloads (P＜0.05，P＜0.01).A similar result was obtained in the isolated circular muscle strips of the gastric body when 5-HT was used as an agonist.The Emaxvalue of contractile responses to CCh and 5-HT in the circular muscle strips of the gastric cardia under 3.0 g preload was increased by 117.4%and 75.7%compared to that under 1.0 g preload.The Emaxvalue of contractile responses to 5-HT in the circular muscle strips of the gastric body under 3.0 g preload was also increased by 115.9%when compared to 1.0 g preload.The Emax(g)value of contractile responses to CCh in four types of muscle strips was 10.453±2.956(cardia under 3.0 g preload)，13.878±2.618(fundus under 2.5 g preload)，10.244±1.843 (gastric body under 2.5 g preload)and 2.585±1.098(pylorus under 2.5 g preload)，respectively.The Emax(g)value of contractile responses to 5-HT in three types of muscle strips was 4.363±1.705(cardia under 3.0 g preload)，3.931±0.615(fundus under 3.0 g preload)and 3.161±0.680(gastric body under 3.0 g preload)，respectively.CONCLUSlON 0.5 g or 1.0 g preload is inadequate for accurate determination of contractile responses mediated by muscarinic receptors and 5-HT receptors in isolated circular muscle strips taken from the rat gastric cardia，fundus，body and pylorus，but 2.0 g preload is optimal for investigating muscarine receptor-or 5-HT receptor-mediated contractile responses of isolated gastric strips of rats.

receptors，muscarine；receptors，5-hydroxytryptamine；stretch；gastric body；fundus；cardia；pylorus

REN Lei-ming，E-mail:ren-leiming＠263.net，Tel:(0311)86266722

R975

A

1000-3002(2014)04-0519-06

10.3867/j.issn.1000-3002.2014.04.008

Foundation item:The project supported by National Program on Key Basic Research Project of China(973 Program)(2012CB518601)；and National Science＆Technology Major Project of China(2011ZX 09102-011-04)

2014-01-09 接受日期:2014-07-14)

(本文編輯:喬 虹)

國家重點基礎研究發(fā)展計劃(973計劃) (2012 CB518601)；國家科技重大專項(2011ZX09102-011-04)

王東凱(1984－)，男，碩士研究生；任雪姣(1985－)，女，碩士，主要從事腫瘤放射治療學研究。

任雷鳴，Tel:(0311)86266722，E-mail: ren-leiming＠263.net

?共同第一作者。