郭 芳，孫應彪，李 盛，蘇 莉，劉志飛，趙 遲

(1.蘭州大學公共衛(wèi)生學院，甘肅蘭州 730000;2.蘭州市疾病預防控制中心，甘肅蘭州 730030)

百草枯(paraquat，PQ)屬有機雜環(huán)類接觸性脫葉劑及除草劑，對人畜均有較強毒性，因缺乏特效解毒劑及有效降低毒物毒性的治療手段，PQ急性中毒是臨床常見除草劑急性中毒之一，病死率高達50% ～80%［1］。氧化應激是目前公認的 PQ中毒機制。研究發(fā)現(xiàn)，NF－κB作為一個氧化應激敏感型轉(zhuǎn)錄因子可被PQ中毒后產(chǎn)生的大量的活性氧(reactive oxygen species，ROS)激活，使機體處于氧化應激狀態(tài)，活化后的NF－κB還可進一步引起炎癥反應和肺組織纖維化的發(fā)生［2］。

腎素－血管緊張素(angiotensin，Ang)系統(tǒng)廣泛存在于腎、心、肺和肝等組織，能夠獨自合成AngⅡ，AngⅡ是機體組織纖維化調(diào)節(jié)器，能夠通過AngⅡ1型受體(AngⅡ type 1 receptor，AT1R)的激活誘導肺成纖維細胞的擴散和肺間質(zhì)膠原蛋白沉積［3－4］。在正常大鼠肺組織中，存在大量 AT1R［5］，AngⅡ與AT1R結(jié)合可引起肺成纖維細胞的擴散進而引起肺部嚴重損傷和肺纖維化。氯沙坦作為AT1R拮抗劑，可保護由高氧引起的小鼠肺損傷并抑制肺部纖維化的發(fā)生［6］。本研究通過建立PQ急性肺損傷大鼠模型，觀察氯沙坦對PQ所致肺組織形態(tài)、氧化應激和NF－κB基因表達水平異常變化的干預作用，為臨床PQ急性中毒治療提供新的思路。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

選擇SPF級成年雄性SD大鼠32只，體質(zhì)量180～220 g，甘肅省中醫(yī)學院實驗動物中心，動物合格證號 SCXK［甘］2011－0001－0001011。

1.2 試劑和儀器

PQ，美國Sigma公司;氯沙坦鉀片，杭州默沙東制藥有限公司。超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)、過氧化氫酶(catalase，CAT)、脂質(zhì)過氧化物(lipid peroxide，LPO)和總抗氧化能力(total antioxidant capacity，T－AOC)測定試劑盒，南京建成生物工程研究所;Trizol試劑，美國Life Technology公司;NF－κB和β肌動蛋白引物(表1)，上海捷瑞生物工程有限公司;逆轉(zhuǎn)錄和實時熒光定量PCR試劑盒，大連寶生物工程有限公司。Eon全功能多波段酶標儀，美國BioTek公司;722型分光光度計，上海精密科學儀器有限公司;BX53光學顯微鏡，日本Olympus公司;SmartSpec Plus核酸蛋白測定儀和 CFX96 Real－Time System，美國 Bio－Rad 公司;Microfuge22R型低溫離心機，美國Beckman公司;TC－512型普通PCR儀，北京瑞爾欣德科技有限公司。

Tab.1 Primer sequences and theoretical amplification lengths

1.3 動物分組和處理

選擇32只健康成年雄性SD大鼠隨機分為正常對照組、PQ染毒組以及氯沙坦干預7 d(PQ+氯沙坦7 d)和14 d(PQ+氯沙坦14 d)組。正常對照組大鼠每天ig給予生理鹽水10 mL·kg－1，連續(xù)15 d。PQ染毒組一次性 ig PQ 40 mg·kg－1染毒，此后每天等容積ig給予生理鹽水至第15天。氯沙坦干預7和14 d組于一次性ig給予PQ 40 mg·kg－1染毒后次日，根據(jù)臨床成人每天用藥等效劑量ig給予氯沙坦10 mg·kg－1，每天1次，連續(xù)7和14 d。

1.4 肺組織病理變化觀察

各組大鼠于給藥第16天采用頸椎脫位法處死，取右肺中葉用4%多聚甲醛固定，常規(guī)制備石蠟切片并行HE染色，觀察肺組織病理學改變，以確定急性肺損傷造模是否成功。光學顯微鏡觀察肺組織病理組織學變化。剩余肺組織用無菌生理鹽水漂洗后液氮中凍存，用于其他指標檢測。

1.5 肺組織勻漿中 T－SOD，CAT，LPO和 T－AOC水平測定

準確稱取左側(cè)肺組織，按質(zhì)量(g):體積(mL)=1∶9的比例加入無菌生理鹽水，冰水浴勻漿，1000×g離心10 min，取上清液BCA法檢測蛋白質(zhì)濃度，并根據(jù)試劑盒操作步驟檢測各項指標，結(jié)果用單位質(zhì)量蛋白質(zhì)中各指標含量表示。

1.6 大鼠肺組織NF－κB mRNA表達水平檢測

取液氮中保存的肺組織約100 mg加入1 mL Trizol于冰浴中勻漿并提取總RNA，用核酸蛋白測定儀測定RNA濃度并確保其A260nm/A280nm在1.8～2.2之間。根據(jù) RNA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書，選擇10 μL反應體系，于 37℃ 15 min，85℃ 5 s，4℃5 min將 RNA逆轉(zhuǎn)錄為 cDNA，－20℃保存。以cDNA為模板，用 NF－κB引物進行實時熒光定量PCR擴增，內(nèi)參照為β肌動蛋白。實時熒光定量PCR反應過程嚴格按照SYBR Premix Ex TapⅡ試劑盒說明書進行。反應條件為95℃預變性30 s，95℃變性5 s，60℃退火30 s，40個循環(huán)。所有樣品均采用相同的閾值得到Ct值并采用Pfaffl法［7］計算NF－κB mRNA的相對表達水平。

1.7 統(tǒng)計學分析

2 結(jié)果

2.1 氯沙坦干預后大鼠肺組織病理改變

如圖1所示，正常對照組肺泡間隔及肺泡腔大小如常，肺泡間隔內(nèi)未見明顯膠原沉積及炎性細胞浸潤，間質(zhì)小血管管壁如常(圖1A)。PQ染毒組肺泡間隔彌漫性顯著增寬，肺泡腔狹窄或閉合，肺泡間隔及肺間質(zhì)內(nèi)大量膠原沉積，成纖維細胞增生，部分區(qū)域可見炎性細胞浸潤，間質(zhì)小血管壁增厚，管腔狹窄(圖1B)。氯沙坦7 d干預組肺損傷比PQ組減輕，肺間質(zhì)膠原沉積減少，但多數(shù)區(qū)域肺間質(zhì)內(nèi)仍有成纖維細胞增生，間質(zhì)小血管管壁仍增厚(圖1C)。氯沙坦14 d干預組肺組織多數(shù)區(qū)域接近正常，肺間質(zhì)膠原沉積進一步減少，間質(zhì)小血管管壁輕微增厚(圖1D)。

Fig.1 Effect of losartan on paraquat(PQ)induced histopathological changes of lung tissuein rats(HE ×200).The rats were ig given losartan 10 mg·kg －1for 7 and 14 d after being single ig given PQ 40 mg·kg －1.A:normal control group;B:PQ group;C － D:losartan intervention for 7 and 14 d groups，respectively.The arrows show lung interstitial capillary.

Tab.2 Effect of losartan on oxidative stress change in lung tissues of rats induced by PQ

2.2 氯沙坦干預后大鼠肺組織氧化應激水平的變化

由表2可見，與正常對照組比較，PQ染毒后大鼠肺組織中T－SOD和CAT活性明顯降低，T－AOC明顯減弱，LPO 含量明顯升高(P ＜0.05，P ＜0.01)。與PQ染毒組比較，氯沙坦干預7 d大鼠肺組織中T－SOD和CAT活性明顯回升(P＜0.05，P＜0.01)，T－AOC活性和LPO含量無明顯變化;氯沙坦干預14 d T－SOD和CAT活性及T－AOC均明顯升高，LPO 含量明顯降低(P ＜0.05，P ＜0.01)，均恢復接近正常水平。提示氯沙坦對PQ急性染毒大鼠肺組織中 T－SOD，CAT，T－AOC 和 LPO 活性或含量的異常變化具有逆轉(zhuǎn)作用。

2.3 氯沙坦干預后大鼠肺組織NF－κB mRNA表達水平的變化

由圖2可見，與正常對照組比較，PQ組大鼠肺組織中 NF－κB mRNA表達水平明顯升高(P＜0.05)。與PQ染毒組比較，氯沙坦干預7和14 d大鼠肺組織中 NF－κB mRNA含量明顯下降(P＜0.05)，基本恢復接近正常水平。

Fig.2 Effect of losartan on NF－κB mRNA expression induced by PQ in lung tissue of rats by real－time quantitative PCR.See Fig.1 for the rat treatment.The NK－κB mRNA expression was analyzed by Pfaffl method.±s，n=8.*P ＜0.05，compared with normal control group;#P ＜0.05，compared with PQ group.

3 討論

據(jù)報道，肺泡上皮細胞和氣管Clara細胞借助多胺攝取途徑將PQ轉(zhuǎn)運入肺并產(chǎn)生大量ROS，導致機體處于氧化應激狀態(tài)，進而引發(fā)鏈式脂質(zhì)過氧化反應，使細胞膜受體、膜蛋白酶和離子通道脂質(zhì)的微環(huán)境發(fā)生改變，引起肺組織氧化性損傷［8］。正常情況下機體內(nèi)存在著消除自由基的防御體系，其中SOD和CAT活性直接反映機體清除ROS的能力［9］。據(jù)報道，PQ進入人體內(nèi)后經(jīng)由NADPH輔助的單電子還原為自由基，該自由基能與氧反應形成超氧陰離子，后者能誘導產(chǎn)生更多的ROS如過氧化氫、羥自由基等，間接使體內(nèi)SOD活力降低，并誘導產(chǎn)生更多的LPO，最終引起肺泡間質(zhì)不可逆的纖維化［10－11］。本研究結(jié)果表明，PQ染毒組肺組織中SOD和CAT活性明顯降低，T－AOC明顯減弱，而LPO含量明顯升高，提示PQ中毒早期氧化應激損害占有重要地位。

NF－κB屬于對氧化還原敏感的Rel蛋白家族。因此，ROS的釋放和氧化還原狀態(tài)的改變可直接激活 NF－κB［12］。被活化的 NF－κB 引起細胞因子網(wǎng)絡調(diào)控失衡，大量炎性因子的產(chǎn)生導致肺部炎癥的發(fā)生并最終引起肺纖維化［2］。本研究結(jié)果表明，PQ染毒后大鼠肺組織病理改變主要表現(xiàn)為肺泡間隔顯著增寬，肺泡腔狹窄或閉合，部分區(qū)域可見炎性細胞浸潤和膠原蛋白沉積;同時肺組織NF－κB mRNA明顯上調(diào)。提示NF－κB參與了PQ急性肺損傷過程。

氯沙坦是常見的AT1R拮抗劑，可選擇性地作用于AT1R，以阻斷內(nèi)源性和外源性的AngⅡ所產(chǎn)生的各種生理反應。在脂多糖誘導的大鼠肺損傷模型中，氯沙坦干預可顯著抑制AT1R和NF－κB活性［13］。此外，氯沙坦可通過抗自由基和阻斷AngⅡ的促炎反應治療平陽霉素引起的大鼠肺損傷［14］。本研究結(jié)果表明，隨著氯沙坦干預時間的延長，PQ染毒組大鼠肺組織中SOD和CAT活性及T－AOC明顯增強，LPO含量明顯降低，NF－κB mRNA表達明顯降低。肺組織病理觀察結(jié)果表明，氯沙坦干預14 d肺組織大多數(shù)區(qū)域未見明顯病變，并接近于正常水平。

綜上所述，氯沙坦通過增強肺組織的抗氧化能力和降低NF－κB mRNA表達而減輕PQ所致的急性肺損傷，為臨床綜合治療PQ急性中毒提供新的思路。

［1］Hwang KY，Lee EY，Hong SY.Paraquat intoxication in Korea［J］.Arch Environ Health，2002，57(2):162－166.

［2］Dinis－Oliveira RJ，Sousa C，Remi?o F，Duarte JA，Navarro AS，Bastos ML，et al.Full survival of paraquat－exposed rats after treatment with sodium salicylate［J］.Free Radic Biol Med，2007，42(7):1017－1028.

［3］Marshall RP，McAnulty RJ，Laurent GJ.AngiotensinⅡis mitogenic for human lung fibroblasts via activation of the type 1 receptor［J］.Am J Respir Crit Care Med，2000，161(6):1999－2004.

［4］Marshall RP，Gohlke P，Chambers RC，Howell DC，Bottoms SE，Unger T，et al.AngiotensinⅡ and the fibroproliferative response to acute lung injury［J］.Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol，2004，286(1):L156－L164.

［5］Campbell DJ， Kladis A， Valentijn AJ. Effects of losartan on angiotensin and bradykinin peptides and angiotensin－converting enzyme［J］.J Cardiovasc Pharmacol，1995，26(2):233－240.

［6］Chou HC， Lang YD， Wang LF， Wu TY，Hsieh YF，Chen CM.AngiotensinⅡ type 1 receptor antagonist attenuates lung fibrosis in hyperoxia－exposed newborn rats［J］.J Pharmacol Exp Ther，2012，340(1):169－175.

［7］Pfaffl MW.A new mathematical model for relative quantification in real－time RT－PCR［J］. Nucleic Acids Res，2001，29(9):e45.

［8］Dinis－Oliveira RJ，De Jesús Valle MJ，Bastos ML，Carvalho F，Sánchez Navarro A.Kinetics of paraquat in the isolated rat lung:influence of sodium depletion［J］.Xenobiotica，2006，36(8):724－737.

［9］Mollace V，Iannone M，Muscoli C，Palma E，Granato T，Rispoli V，et al.The role of oxidative stress in paraquat－induced neurotoxicity in rats:protection by non peptidyl superoxide dismutase mimetic［J］.Neurosci Lett，2003，335(3):163－166.

［10］Suntres ZE.Role of antioxidants in paraquat toxicity［J］.Toxicology，2002，180(1):65－77.

［11］Hagiwara S，Iwasaka H，Matsumoto S，Noguchi T.An antisense oligonucleotide to HSP47 inhibits paraquat－induced pulmonary fibrosis in rats［J］.Toxicology，2007，236(3):199－207.

［12］H?cker H，Karin M.Regulation and function of IKK and IKK－related kinases［J］.Sci STKE，2006，2006(357):re13.

［13］Liu L，Qiu HB，Yang Y，Wang L，Ding HM，Li HP.Losartan，an antagonist of AT1 receptor for angiotensin Ⅱ， attenuates lipopolysaccharide－induced acute lung injury in rat［J］.Arch Biochem Biophys，2009，481(1):131－136.

［14］Yao HW， Zhu JP， Zhao MH， Lu Y. Losartan attenuates bleomycin－induced pulmonary fibrosis in rats［J］.Respiration，2006，73(2):236－242.