張秀梅，姜 超，2，于素芳

(1.山東大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院勞動(dòng)衛(wèi)生與環(huán)境衛(wèi)生學(xué)研究所，山東濟(jì)南 250012；2.濟(jì)南市市中區(qū)疾病預(yù)防控制中心，山東濟(jì)南 250022)

維生素E對(duì)二甲基甲酰胺致小鼠慢性肝損傷的預(yù)防作用

張秀梅1，姜 超1，2，于素芳1

(1.山東大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院勞動(dòng)衛(wèi)生與環(huán)境衛(wèi)生學(xué)研究所，山東濟(jì)南 250012；2.濟(jì)南市市中區(qū)疾病預(yù)防控制中心，山東濟(jì)南 250022)

目的 探討維生素E(Vit E)對(duì)二甲基甲酰胺(DMF)致小鼠慢性肝損傷的預(yù)防作用。方法 將40只健康SPF級(jí)雄性昆明小鼠隨機(jī)分為正常對(duì)照組、Vit E對(duì)照組、DMF染毒模型組和DMF＋Vit E干預(yù)組,每組10只。DMF染毒模型組和DMF＋Vit E干預(yù)組ig給予DMF 0.5 g·kg－1染毒；2 h后,Vit E對(duì)照組和DMF＋Vit E干預(yù)組ig給予Vit E 5 mg·kg－1,每天1次,連續(xù)30 d。用試劑盒測(cè)定小鼠血清谷草轉(zhuǎn)氨酶(GOT)、谷丙轉(zhuǎn)氨酶(GPT)和黃嘌呤氧化酶(XOD)活性及丙二醛(MDA)含量,HE染色法觀察肝組織病理改變。結(jié)果 與正常對(duì)照組比較,Vit E對(duì)照組小鼠上述各指標(biāo)均無(wú)顯著變化,DMF染毒模型組小鼠血清中GOT,GPT和XOD活性及肝組織MDA含量均升高(P＜0.05,P＜0.01),且肝組織存在明顯的病理?yè)p傷,肝細(xì)胞核固縮,細(xì)胞水腫、變性、壞死。與DMF染毒模型組比較,DMF＋Vit E干預(yù)組小鼠血清GOT,GPT和XOD活性及肝組織MDA含量均降低(P＜0.05,P＜0.01),肝組織病理?yè)p傷明顯減輕,幾乎看不到變性和水腫細(xì)胞。結(jié)論 Vit E對(duì)DMF引起的小鼠慢性肝損傷具有一定的預(yù)防作用。

二甲基甲酰胺；維生素E；肝損傷

二甲基甲酰胺(dimethylformamide，DMF)是一種重要的化工原料，廣泛用于纖維、皮革和醫(yī)藥等行業(yè)。隨著現(xiàn)代工業(yè)的發(fā)展，DMF的消耗量不斷增加，接觸DMF職業(yè)人群也不斷擴(kuò)大，DMF職業(yè)中毒報(bào)道不斷增多。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，DMF具有肝毒性，可致急性和慢性肝損傷[1－2]。維生素E(vitamin E，Vit E)具有抗氧化作用，動(dòng)物實(shí)驗(yàn)和臨床試驗(yàn)結(jié)果均表明，其具有較好的肝保護(hù)作用[3－4]，至于Vit E是否可預(yù)防DMF所致慢性肝損傷尚未見(jiàn)報(bào)道。本研究探討Vit E對(duì)DMF所致慢性肝損傷的預(yù)防作用。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物、試劑和儀器

選擇健康SPF級(jí)雄性昆明小鼠40只，體質(zhì)量28～32 g，由山東大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，動(dòng)物合格證號(hào)為SCXK(魯)20090001。動(dòng)物飼養(yǎng)溫度為21～25℃，相對(duì)濕度為40%～60%，自然光照，普通飼料喂養(yǎng)。實(shí)驗(yàn)期間，大鼠可自由飲水、攝食。DMF，分析純，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，稱(chēng)取適量的DMF，用蒸餾水配制成200 g·L－1的DMF溶液，配制成DMF染毒液；Vit E(濃度為950 g·L－1)，美國(guó)Sigma公司，批號(hào)為T(mén)3634，稱(chēng)取適量的Vit E，用玉米油配制成2 g·L－1的Vit E溶液；谷草轉(zhuǎn)氨酶(glutamic oxaloacetic transaminase，GOT)、谷丙轉(zhuǎn)氨酶(glutamic-pyruvic transaminase，GPT)、黃嘌呤氧化酶(xanthine oxidase，XOD)、丙二醛(malondialdehyde，MDA)檢測(cè)試劑盒和BCA蛋白定量檢測(cè)試劑盒均購(gòu)自南京建成生物工程研究所；其他試劑均為國(guó)產(chǎn)或進(jìn)口分析純。Infinite 200 PRO型酶標(biāo)儀，瑞士Tecan公司；UV-2100型分光光度計(jì)，美國(guó)UNICO Apparatus公司；D-37520型低溫離心機(jī)，德國(guó) Heraeu Biofuge Stratos公司；DY89-Ⅱ型電動(dòng)玻璃勻漿機(jī)，寧波新芝生物科技股份有限公司；FA1104型電子天平，上海電子天平儀器廠；MDF-382E型超低溫冰箱，日本三洋公司。

1.2 動(dòng)物分組和處理

昆明小鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)7 d后，按體質(zhì)量隨機(jī)分為4組，分別為正常對(duì)照組、Vit E對(duì)照組、DMF染毒模型組和DMF＋Vit E干預(yù)組，每組10只。DMF染毒模型組和DMF＋Vit E干預(yù)組ig給予DMF 0.5 g·kg－1，正常對(duì)照組和Vit E對(duì)照組分別給等體積蒸餾水；2 h后，Vit E對(duì)照組和DMF＋Vit E干預(yù)組ig給予Vit E 5 mg·kg－1，正常對(duì)照組和DMF染毒模型組分別ig給予等體積玉米油2.5 mL·kg－1，每天1次，連續(xù)30 d。

1.3 小鼠一般狀況觀察

每天觀察小鼠飲食、飲水、行為活動(dòng)、肌肉、毛色、黏膜、尿液、糞便等有無(wú)異常，每5 d測(cè)1次體質(zhì)量。

1.4 肝質(zhì)量和臟器系數(shù)的測(cè)定

第31天8:00，小鼠空腹稱(chēng)重后處死，迅速分離肝，稱(chēng)重并計(jì)算肝系數(shù):肝系數(shù)＝肝質(zhì)量(g)/體質(zhì)量(g)×100。將肝組織立即放入液氮中，－80℃保存，備用。

1.5 血清GPT，GOT和XOD活性測(cè)定

處死小鼠前摘眼球取血，常規(guī)分離血清，置－20℃保存。采用相應(yīng)檢測(cè)試劑盒測(cè)定血清中GOT，GPT和XOD活性，操作過(guò)程嚴(yán)格按照試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。

1.6 肝組織MDA含量測(cè)定

取肝組織0.4～0.5 g，在冷生理鹽水中漂洗后，濾紙吸干，稱(chēng)重，按質(zhì)量體積比1∶9加入生理鹽水并制成肝勻漿。取勻漿液，在低溫下，以2500×g離心15 min，吸上清液2.5 mL，置－80℃保存。采用相應(yīng)試劑盒測(cè)定肝勻漿中蛋白質(zhì)濃度和MDA含量，操作過(guò)程嚴(yán)格按照試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。

1.7 肝組織病理變化觀察

取肝左葉以4%甲醛固定，梯度乙醇脫水，石蠟包埋，切片，HE染色，光鏡觀察肝組織病理變化。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 Vit E對(duì)DMF染毒小鼠一般狀況的影響

正常對(duì)照組和 Vit E對(duì)照組小鼠表現(xiàn)正常；DMF染毒模型組小鼠均出現(xiàn)輕微中毒現(xiàn)象，表現(xiàn)為活動(dòng)減少、行動(dòng)遲緩、反應(yīng)遲鈍、被毛蓬松、豎毛等，無(wú)死亡；DMF＋Vit E干預(yù)組小鼠一般狀況基本正常，個(gè)別小鼠出現(xiàn)輕微中毒現(xiàn)象。染毒第20～30天，DMF染毒模型組和DMF＋Vit E干預(yù)組小鼠體質(zhì)量均低于對(duì)照組(P＜0.01)。Vit E對(duì)照組與正常＋于DMF染毒模型組，但差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(圖1)。

Fig.1 Effect of vitamin E(Vit E)on body mass of mice exposed to dimethylformamide(DMF).The mice in DMF modelandDMF＋VitEgroupswereiggivenDMF 0.5 g·kg－1，then Vit E control group and DMF＋Vit E group were ig given Vit E 5 mg·kg－1after 2 h，once a day for 30 d.，n＝10.??P＜0.01，compared with normal control group.

2.2 Vit E對(duì)DMF染毒小鼠肝質(zhì)量及肝系數(shù)的影響

與正常對(duì)照組比較，Vit E對(duì)照組、DMF染毒模型組和DMF＋Vit E干預(yù)組小鼠的肝質(zhì)量均無(wú)顯著改變，DMF染毒模型組和DMF＋Vit E干預(yù)組小鼠的肝系數(shù)均升高(P＜0.01)。DMF＋Vit E干預(yù)組與DMF染毒模型組比較小鼠的肝質(zhì)量及肝系數(shù)無(wú)明顯變化(表1)。

Tab.1 Effect of Vit E on liver mass of mice exposed to DMF

2.3 Vit E對(duì)DMF染毒小鼠血清GOT，GPT和XOD活性的影響

與正常對(duì)照組比較，Vit E對(duì)照組小鼠血清中GOT，GPT和XOD活性均無(wú)顯著變化；而DMF染毒模型組小鼠血清中GOT，GPT和XOD活性均升高(P＜0.05，P＜0.01)。與DMF染毒模型組比較，DMF＋Vit E干預(yù)組小鼠血清GOT，GPT和XOD活性均降低(P＜0.05，P＜0.01)(表2)。

Tab.2 Effect of Vit E on glutamic-oxaloacetic transaminase(GOT)， glutamic-pyruvic transaminase (GPT)and xanthine oxidase(XOD)in serum of mice exposed to DMF

2.4 Vit E對(duì)DMF染毒小鼠肝組織MDA含量的影響

與正常對(duì)照組比較，Vit E對(duì)照組小鼠肝組織MDA含量無(wú)顯著變化；DMF染毒模型組小鼠MDA含量升高(P＜0.01)。與DMF染毒模型組比較，DMF＋Vit E干預(yù)組小鼠肝組織MDA含量降低(P＜0.01)(表3)。

Tab.3 Effect of Vit E on malondialdehyde(MDA)in liver of mice exposed to DMF

2.5 Vit E對(duì)DMF染毒小鼠肝組織病理的影響

Vit E對(duì)慢性DMF染毒致小鼠肝損傷的病理學(xué)改變見(jiàn)圖1。正常對(duì)照組(圖2A)和Vit E對(duì)照組(圖2B)小鼠肝病理切片正常；DMF染毒模型組可見(jiàn)肝細(xì)胞核固縮，核周空泡，細(xì)胞水腫、變性、壞死，細(xì)胞界限不清(圖2C)；DMF＋Vit E干預(yù)組肝組織結(jié)構(gòu)基本正常(圖2D)。

Fig.2 Effect of Vit E on histopathological change in liver of mice exposed to DMF(HE×200).See Fig.1 for the mouse treatment.A:normal control group；B:Vit E control group；C:DMF model group；D:DMF＋Vit E group.The arrow showed the liver cellnucleus pycnosis， cellular edema，degeneration，necrosis and cellular boundaries were not clear.

3 討論

DMF是一種工業(yè)毒物，可以使肝內(nèi)脂質(zhì)過(guò)氧化程度增強(qiáng)，導(dǎo)致血清GOT，GPT和XOD活性升高，肝組織MDA含量增加[5－7]。而Vit E有很強(qiáng)的抗氧化作用，可以保護(hù)肝細(xì)胞免受自由基損傷，有效降低染毒動(dòng)物血清的GOT，GPT和XOD活性，使肝組織MDA含量降低[8－12]。

本研究結(jié)果表明，Vit E對(duì)照組各指標(biāo)與正常對(duì)照組相比均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，可以認(rèn)為此劑量下Vit E可被正常小鼠代償，選擇的干預(yù)劑量是合適的。DMF染毒模型組小鼠出現(xiàn)中毒癥狀；體質(zhì)量明顯降低；血清GOT，GPT和XOD活性顯著升高，肝組織MDA含量增加，表明該染毒劑量DMF慢性染毒可引起小鼠明顯的肝損傷。DMF＋Vit E干預(yù)組小鼠體質(zhì)量較DMF染毒模型組有所增加，血清中GOT，GPT和XOD活性及肝組織MDA含量均明顯降低，這個(gè)結(jié)果與文獻(xiàn)報(bào)道的結(jié)果[5－12]一致，表明預(yù)防性給予Vit E后可以提高肝抗氧化能力，降低脂質(zhì)過(guò)氧化損傷，促進(jìn)DMF染毒后肝恢復(fù)。

本研究的結(jié)果提示，在該DMF染毒劑量下，給予Vit E 5 mg·kg－1不能完全預(yù)防DMF引起的慢性肝損傷，但能部分緩解DMF引起的慢性肝損傷。Vit E對(duì)DMF導(dǎo)致的小鼠慢性肝損傷具有一定的預(yù)防作用。

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Preventive effect of vitamin E on chronic liver injury induced by N，N-dimethylformamide in mice

ZHANG Xiu-mei1，JIANG Chao1，2，YU Su-fang1
(1.Department of Occupational and Environmental Health，School of Public Health，Shandong University，Jinan 250012，China；2.Center for Disease Prevention and Control of Shizhong District of Jinan，Jinan 250022，China)

OBJECTlVE To study the preventive effect of vitamin E(Vit E)on chronic liver injury induced by N，N-dimethylformamide(DMF).METHODS Healthy male Kunming mice were randomly divided into 4 groups，10 mice in each group.The mice in DMF model group and DMF＋Vit E group were ig given DMF 0.5 g·kg－1，while Vit E control group and DMF＋Vit E group were ig given Vit E 5 mg·kg－1after 2 h once a day for 30 d.The activity of serum glutamic-oxaloacetic transaminase(GOT)，glutamicpyruvic transaminase(GPT)and xanthine oxidase(XOD)and the content of malondialdehyde(MDA) in liver tissue were measured with corresponding kits.The pathological changes of liver tissue were observed with HE staining.RESULTS Compared with the normal control group，the activity of serum GOT，GPT and XOD of the DMF model group was significantly elevated(P＜0.05，P＜0.01)，and the liver cell nucleus pycnosis，cellular edema，degeneration，necrosis occurred.Compared with DMF model group，the activity of serum GOT，GPT and XOD of DMF＋Vit E group were all significantly reduced(P＜0.05，P＜0.01)，the content of MDA in liver tissue was significantly diminished(P＜0.01)，but histopathological changes of liver tissue were significantly improved.CONCLUSlON Vit E has preventive effect on chronic liver damage induced by DMF through antioxidation.

dimethylformamide；vitamin E；liver damage

YU Su-fang，E-mail:sufangyu＠sdu.edu.cn，Tel:(0531)88382137

R977.25

A

1000-3002(2014)04-0515-04

10.3867/j.issn.1000-3002.2014.04.007

Foundation item:The project supported by Science and Technology Development Planning of Shandong Province (2012GSF11854)

2013-12-24 接受日期:2014-04-15)

(本文編輯:齊春會(huì))

山東省科技發(fā)展計(jì)劃(2012GSF11854)

張秀梅(1987－)，女，碩士研究生，從事職業(yè)毒理學(xué)研究，E-mail:847326709＠qq.com；于素芳(1961－)，女，博士，碩士生導(dǎo)師，從事職業(yè)毒理學(xué)研究。

于素芳，E-mail:sufangyu＠sdu.edu.cn，Tel:(0531)88382137