祝玲玲 ,朱平安 ,蔡蘭蘭 ,金 嫻 ,施培瑤 ,吳 翔

(1.深圳市第七人民醫(yī)院檢驗科,廣東深圳518081;2.中南大學(xué)湘雅醫(yī)學(xué)院病原生物系)

原發(fā)性肝細(xì)胞癌在東南亞和中國是最常見的惡性腫瘤之一。已有研究表明,長期慢性HBV感染以及HBV X基因突變與原發(fā)性肝細(xì)胞癌(hepatocellular carcinoma,HCC)發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。以往研究發(fā)現(xiàn),肝癌組織中存在HBx-d382、HBx-d431缺失型突變體,這些缺失型突變體構(gòu)建的真核表達(dá)載體轉(zhuǎn)入QSG7701肝細(xì)胞后,能加速Q(mào)SG7701肝細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化,有明顯的致瘤作用[1-2]。由于早期診斷、早期治療是提高原發(fā)性肝細(xì)胞癌生存率的關(guān)鍵,為了早期診斷肝細(xì)胞癌,本研究在前期研究的基礎(chǔ)上,建立了檢測HBx-d382和HBx-d431突變體特異性抗體的ELISA方法,并對正常人、慢性乙肝病毒感染者和肝細(xì)胞癌病人血清進(jìn)行檢測,現(xiàn)將結(jié)果報告如下。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 HBx-d382和HBx-d431特異性多肽抗原的制備 采用生物信息學(xué)方法,對乙肝病毒突變體HBx-d382、HBx-d431和乙肝病毒參考序列(AF282917)X基因氨基酸序列進(jìn)行分析,篩選出HBx蛋白共同抗原肽(HBxP)、HBx-d382特異性多肽(HBxP-d382)和HBx-d431特異性多肽(HBxP-d431),其氨基酸序列分別為 ARDVLCLRPVGA、CIHQHHANWSVTFS、MIFVLGGCRHKLVCIF。 采用多肽合成法制備多肽抗原?？乖挠缮虾Ｉど锕こ碳夹g(shù)服務(wù)有限公司合成。

1.1.2 試劑 辣根過氧化物酶(HRP)標(biāo)記的SPA購自北京鼎國生物技術(shù)發(fā)展中心,為美國Southern-Biotech公司產(chǎn)品;包被緩沖液0.05 mol/L、pH值9.6的碳酸鹽緩沖液,稀釋液為pH值7.2的磷酸鹽緩沖液(PBS,含0.05%吐溫-20和10%正常兔血清),PBS緩沖洗滌液 pH值7.4,底物顯色溶液(TMB),2.5 mL/L H2SO4終止液等試劑均由上海榮盛生物技術(shù)有限公司提供。

1.1.3 標(biāo)本 350例HBV感染者血清標(biāo)本來自2005年5月～2012年12月深圳市第七人民醫(yī)院、中南大學(xué)湘雅醫(yī)院和邵陽市中心醫(yī)院門診和住院患者。其中慢性HBV感染者266例,男182例,女84例,年齡21～61歲;肝細(xì)胞癌患者84例,男55例,女29例,年齡25～65歲。上述患者均為乙肝病毒表面抗原陽性,診斷依據(jù)為2000年西安第10次病毒性肝炎及肝病學(xué)術(shù)會議修訂的診斷分型標(biāo)準(zhǔn)。隨機(jī)選擇HBV血清學(xué)標(biāo)志物陰性健康成人20名作為正常對照組,年齡23～62歲。

1.1.4 血清稀釋度和酶結(jié)合物濃度的選擇 采用方陣滴定法,確定血清稀釋度和酶結(jié)合物最佳濃度。

1.2 抗HBx-d382和抗HBx-d431特異性抗體檢測

采用間接法,將 HBx-d382和HBx-d431特異性抗原肽稀釋后包被聚丙乙烯反應(yīng)板。37°C水浴1 h,4°C冰箱過夜,PBS緩沖洗滌液洗板5次并扣干。 每孔加入100 μL封閉液,37°C水浴1 h,4°C冰箱過夜,PBS緩沖洗滌液洗板5次并扣干。在上樣孔中加入稀釋的血清,37℃水浴1 h,PBS緩沖洗滌液洗板5次并扣干。加入HRP標(biāo)記的SPA;水浴1 h,PBS洗板5次并扣干,加入底物液(底物A為H2O2,底物 B為 3,3′,5,5′四甲基聯(lián)苯胺)顯色10 min,加入終止液5 min后,1 h內(nèi)用酶標(biāo)儀450/630 nm波長檢測各孔的吸光度A。結(jié)果判斷:臨界值CO=陰性對照孔A均值×2.1。測定A值/CO≥1為陽性,測定A值/CO＜1為陰性。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法

使用SPSS17.00軟件,采用χ2檢驗進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析。P＜0.05為差異有顯著性。

2 結(jié) 果

2.1 包被抗原的最佳濃度、血清標(biāo)本與酶結(jié)合物最佳稀釋度

通過生物信息和多肽合成的方法,篩選并合成出了HBx蛋白共同抗原肽、HBx-d382特異性多肽和HBx-d431特異性多肽,經(jīng)方陣滴定法確定,HBxd382和HBx-d431特異性抗原肽最佳包被濃度為25 μg/mL,血清標(biāo)本最佳稀釋度為1∶10,酶結(jié)合物最佳稀釋度為1∶6 000。

2.2 重復(fù)性

取一中強(qiáng)陽性的標(biāo)本同一酶標(biāo)板測定15孔,其批內(nèi)變異系數(shù)為5.20%,用不同批酶標(biāo)板對同一中強(qiáng)陽性的標(biāo)本反復(fù)檢測15次,其批間變異系為7.90%,試劑重復(fù)性好。

2.3 慢性 HBV感染者不同血清學(xué)模式抗HBx抗體檢測

266例慢性HBV感染者不同血清學(xué)模式HBx抗體檢測結(jié)果見表1,抗HBxP為HBx蛋白共同抗原肽抗體,抗HBx-d382為HBx-d382特異性多肽抗體,抗HBx-d431為HBx-d431特異性多肽抗體。在3種HBsAg陽性常見血清學(xué)模式中,HBsAg(+)/HBcAb(+)模式抗HBx-d382陽性率最高,陽性率為68.75%,其次為HBsAg(+)/HBeAg(+)/HB-cAb(+)模式,陽性率為56.52%;這兩組模式抗HBx-d382陽性率明顯高于和HBsAg(+)/HBeAb(+)/HBcAb(+)模式(χ2值分別為13.85,20.68;P＜0.05)。而抗HBxP和抗HBx-d431陽性率在這些血清學(xué)模式之間差異無顯著性(P＞0.05)。

表1 慢性HBV感染者不同血清學(xué)模式HBx抗體檢測結(jié)果(例,%)

2.4 肝細(xì)胞癌病人血清中抗HBx抗體的檢測

從表2可見,肝癌組、HBV組與正常對照組比較,抗HBxP、抗HBx-d382、抗HBx-d431抗體陽性率明顯高于正常對照組(χ2值分別為43.26,69.23,80.01;P＜0.05)。肝癌組與HBV組比較,肝細(xì)胞癌病人抗HBxP、抗HBx-d382、抗HBx-d431抗體陽性率明顯增高(χ2值分別為103.42,78.01,63.12;P＜0.05)。

表2 肝細(xì)胞癌病人與HBV感染者血清中HBx抗體檢測結(jié)果(例,%)

3 討 論

原發(fā)性肝細(xì)胞癌是世界上最常見的惡性腫瘤之一,每年大約引起40萬人死亡。大量流行病學(xué)調(diào)查表明,長期慢性乙肝病毒感染是導(dǎo)致HCC的主要病因,且HBV感染者發(fā)生肝細(xì)胞癌的概率大約是非感染者的100～400倍[3]。感染的HBV DNA可整合至肝細(xì)胞上,整合的位點恰好位于HBx基因區(qū),且整合的HBx基因經(jīng)常斷裂不全。斷裂的HBx基因連接在細(xì)胞DNA上,轉(zhuǎn)錄成融合的蛋白。已有研究表明,HBx基因及其編碼蛋白與肝細(xì)胞癌發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)[4]。肝癌組織中HBx基因缺失型突變體,表達(dá)截短的HBx蛋白導(dǎo)致HBx功能發(fā)生變化,參與肝細(xì)胞的惡性轉(zhuǎn)化[2,5-6],促進(jìn)肝癌細(xì)胞的增殖[7]。我們在前期研究中發(fā)現(xiàn),肝癌組織中存在 HBxd382、HBx-d431缺失型突變體,這些缺失型突變體能加速Q(mào)SG7701肝細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化[2],促進(jìn)LO2肝細(xì)胞的增殖和細(xì)胞周期素D1的表達(dá)[8-9]。為了進(jìn)一步研究HBx-d382、HBx-d431缺失型突變體在早期診斷肝細(xì)胞癌上的意義,本研究制備了HBx-d382、HBx-d431缺失型突變體特異性多肽,建立了檢測HBx-d382、HBx-d431缺失型突變體特異性抗體的ELISA法,并對肝細(xì)胞癌病人、慢性HBV感染者和正常人血清進(jìn)行檢測。研究結(jié)果表明,不同血清學(xué)模式的慢性HBV感染者抗HBx-d382與抗HBxd431特異性抗體陽性率是不一樣的。HBsAg(+)/HBcAb(+)模式抗HBx-d382陽性率(68.75%)和HBsAg(+)/HBeAg(+)/HBcAb(+)模式陽性率(56.52%)明顯高于HBsAg(+)/HBeAb(+)/HB-cAb(+)模式陽性率(27.66%)(P＜0.05);HBsAg(+)/HBeAb(+)/HBcAb(+)模式抗HBx-d431陽性率(52.13%)雖然高于HBsAg(+)/HBeAg(+)/HBcAb(+)模式(39.13%)和 HBsAg(+)/HBcAb(+)模式(37.50%),但其與抗HBxP一樣,各血清學(xué)模式之間陽性率無顯著性差異(P＞0.05)。這提示抗HBx-d382與抗HBx-d431 特異性抗體陽性率與HBV感染的進(jìn)程、HBV血清學(xué)模式轉(zhuǎn)變有關(guān)。同時本研究還發(fā)現(xiàn),肝細(xì)胞癌病人血清中抗HBx-d382與抗HBx-d431特異性抗體陽性率明顯高于慢性HBV感染者(P＜0.05),提示抗HBx-d382與抗HBx-d431特異性抗體的出現(xiàn)可能與HCC發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。

由此可見,檢測慢性HBV感染者和肝細(xì)胞癌病人血清中抗HBx-d382與抗HBx-d431特異性抗體,對于了解HBV感染的進(jìn)程、HBV血清學(xué)模式轉(zhuǎn)變、肝細(xì)胞癌發(fā)生發(fā)展有非常重要的意義,可以用于HBV攜帶者及慢性乙肝病人的監(jiān)測。

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