(株洲市中心醫(yī)院燒傷整形科,湖南株洲412008)

皮瓣移植容易發(fā)生缺血性壞死,而且一旦出現(xiàn),處理較為困難,容易引起醫(yī)患矛盾,眾多實驗證實,熱休克蛋白(heat shock proteins,HSPs)對皮瓣有明顯的保護作用,減少皮瓣缺血缺氧造成的損害,減輕細胞損傷、保護細胞活性有很大作用。大鼠進行預先熱應激處理,缺血再灌注損傷明顯減輕[1],預先進行熱休克處理對缺血皮瓣組織存活有改善作用。熱休克反應(heat shock response,HSR)是機體應激反應中的一種重要反應,熱休克蛋白(HSPs)是熱休克反應表達的一組蛋白,保護細胞具有重要意義[1]。熱休克轉錄因子-1(HSF-1)通過調(diào)控影響熱休克蛋白表達,HSF-1以單體形式存在于胞漿中,正常狀態(tài)下無活性,激活后轉變成二聚體,移位至胞核,啟動熱休克元件(heat shock element,HSE)開始相應表達[2]。熱休克預處理改善皮瓣存活率的機制鮮見詳細報道。本研究旨在通過活體鼠背缺血軸型皮瓣模型,觀測 HSP70、HSF1在皮瓣熱應激處理后的動態(tài)變化,探索減輕皮瓣缺血損傷的理論基礎及有效措施。

1 材料與方法

1.1 動物模型及分組

雄性Sprague Dawley大鼠96只(SPF級),體重180～220 g,由中南大學湘雅醫(yī)學院實驗動物學部提供。稱重后,按編號隨機將動物分為缺血組、實驗組(HSP+缺血組)。皮瓣模型采用大鼠背部軸型皮瓣[3],每組48只大鼠分別阻斷蒂部后第1 h、2 h、4 h、6 h、8 h、10 h 取標本,規(guī)定以皮瓣邊緣中遠 1/4處為標本取材點。缺血組:皮瓣模型制備后,阻斷皮瓣蒂部第 1 h、2 h、4 h、6 h、8 h、10 h 共 6 個時間點(阻斷方法:使用血管夾帶橡皮套阻斷血管蒂,壓力以阻斷動脈血運為準),每時間點8只,其中4只直接取標本,4只觀測皮瓣存活情況;實驗組(HSP+缺血組):先予以熱應激處理,置于紅外線加熱燈下,使其肛溫升至42℃并維持30 min(用715型針型半導體測溫計監(jiān)測),室溫下恢復24 h,24 h后制作皮瓣,之后與缺血組相同。

1.2 標本采集

標本采集點為皮瓣遠端壞死近側成活處皮瓣全層組織,大鼠在達到要求后都采用心臟空氣注入栓塞法致死。標本先置于液氮并保存于-80℃。隨后用含有20 mmol/L Hepes、20%甘油、0.2 mmol/L DL-巰基蘇糖醇的溶液勻漿、離心,用BioRad試劑盒定蛋白含量。樣品進行Western blots。用HSP70與提取的HSP轉移膜反應,用抗鼠過氧化酶進行檢測,密度儀檢測放射自顯影的印跡。

1.3 動物模型制備

以1%戊巴比妥鈉(40 mg/kg)腹腔注入麻醉,皮瓣的切取:大鼠背部軸型皮瓣作為皮瓣模型[3]范圍為:前界是肩胛骨下角水平線,后界是髂嵴水平線下1.5～2.3 cm,內(nèi)界是鼠背中線,外界為中線外2.5～3.5 cm,此皮瓣含有3個血管領域,以旋髂深動脈為蒂包括肋間后動脈和胸外側動脈兩個相鄰的血管領域。皮瓣大小約5 cm ×2.5 cm。沿預定線切開皮膚、肉膜組織,然后剝離,遇到穿支則切斷,切忌損傷胸外側動脈、旋髂深動脈的穿支。將皮瓣縫合成皮管,以前后界為蒂,直接拉攏縫合皮瓣供區(qū)。

1.4 指標檢測皮瓣存活率的測定

皮瓣存活7日后,存活面積(%)=(皮瓣面積-壞死面積)/皮瓣面積×100%,依皮瓣存活的百分率進行統(tǒng)計學分析。HSP70和HSF1的檢測:HSP70和HSF1單克隆抗體、Western blot檢測試劑盒(武漢博士德生物工程公司進口分裝)等及圖像分析儀。采用Western印跡法測定缺血組及實驗組皮瓣中HSP70和HSF1。

1.5 統(tǒng)計學分析

采用SPSS11.0統(tǒng)計軟件包,對3組之間的皮膚成活面積及HSF1和 HSP70(光密度)進行統(tǒng)計學分析(t檢驗),數(shù)據(jù)以均數(shù)±標準差表示,以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結 果

2.1 皮瓣成活率

實驗發(fā)現(xiàn),缺血組的大鼠背部軸型皮瓣隨著缺血時間的增加存活率均逐漸降低,較實驗組(HSP+缺血組)明顯下降,差異有顯著性(P＜0.05,表1)。

表1 兩組大鼠皮瓣蒂部不同阻斷時間存活率比較(%)

2.2 HSP70和HSF1的檢測結果

缺血組及實驗組HSP70和HSF1的表達通過Western blot檢測,檢測結果見圖1。實驗組比缺血組表達增多,缺血組及實驗組每個時間點的HSF1比較,差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.01)。

圖1 各組HSF1和HSP70表達Western blot檢測結果

2.3 皮瓣存活率與HSF1和HSP70的關系

先將HSF1缺血組、HSF1實驗組每個時間點上HSF1信號灰度值與缺血組、實驗組相應時間點上的成活率進行相關性分析,再將HSP70缺血組、HSP70實驗組每個時間點上HSP70信號灰度值與缺血組、實驗組相應時間點上的成活率進行相關性分析,發(fā)現(xiàn)皮瓣中HSP70和HSF1的表達與皮瓣存活率呈正相關(y=3.374 5+0.354 ln x,r=0.754 7,P＜0.01)。見表2。

表2 缺血組與實驗組HSF1和HSP70表達的信號灰度值

3 討 論

HSR是普遍存在生物機體中,其報告一系列蛋白,如最小的熱休克蛋白泛素、HSP27、HSP60、HSP70、HSP90等等。Locke等[4]發(fā)現(xiàn)機體中HSP70量最多,存在于各種細胞中,當機體處于應激反應或高溫時,這種反應能夠改變生物體的基因表達,基因表達的改變直接誘導熱休克蛋白(HSPs)表達,在這個過程中,熱休克蛋白轉錄因子(heat shock transcription factors,HSFs)直接參與熱休克蛋白表達的調(diào)控。這一族熱休克轉錄因子家族成員很多,而在參與熱休克反應調(diào)控中,起主要作用的是HSF1。機體在應激等情況下,HSF1激活HSPs,從而啟動熱休克基因的轉錄,其產(chǎn)物HSPs表達增加。Black等[5]認為,當機體在應急情況下,HSP70合成會增多,維持細胞內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定,保護細胞不受傷害,而且HSP70有明顯的抗凋亡作用,阻斷相關應急激酶的激活,減少一氧化氮的合成[6]。李新枝等[7]在研究丙戊酸對大鼠急性脊髓損傷的保護作用時發(fā)現(xiàn)丙戊酸通過減少神經(jīng)細胞凋亡和誘導HSP70表達,對脊髓損傷起到保護作用,證明了HSP70對神經(jīng)的保護作用。一般情況下,HSF1以無活性單體形式存在胞漿中,當機體處于應激狀態(tài)時,細胞內(nèi)環(huán)境發(fā)生變化,HSF1單體通過其羧基端的三聚體相互結合形成三聚體結構,使HSF1單體向三聚體轉化。HSF1三聚體形成后,迅速移入核內(nèi),并通過氨基端的DNA結合結構域(DNA binding domain,DBD)與下游基因啟動子區(qū)的熱休克元件(heat shock element,HSE)相結合,調(diào)控下游基因的轉錄[8]。HSF1除了能夠誘導HSPs的活化外,還能夠調(diào)控一些非熱休克基因的表達,如一些炎癥因子。

實驗結果顯示,實驗組皮瓣中HSP70和HSF1的表達比缺血組增多,而且實驗組皮瓣成活率明顯提高,Western blot結果顯示,在動物熱休克蛋白的表達中,熱預處理組明顯高于單純?nèi)毖M,提示熱休克蛋白的產(chǎn)生與預熱能誘導有明顯的關系。預熱能誘導熱休克蛋白產(chǎn)生,對移植的皮瓣具有保護作用。在實驗過程中,通過觀察不同時間點對HSP表達的影響,在設計1、2、4、6、8、10 h 缺血時間,結果表明動物熱休克反應4 h之內(nèi)預熱產(chǎn)生效果最好,這對臨床都有一定的價值。

采用大鼠鼠背軸型皮瓣為動物模型,形成蒂部位于腹側的超長軸型皮瓣,發(fā)現(xiàn)在通過熱應激預處理的皮瓣組織細胞中有大量的HSP70合成,由此推斷熱休克反應產(chǎn)生HSP70在保護皮瓣中有很重要的作用。本實驗采用Western印跡法對其機制進行了初步的探討。大鼠鼠背軸型 皮瓣組織細胞在熱應激預處理后,各時間點HSF1均較未經(jīng)熱應激預處理的單純?nèi)毖M升高。在IPC后4～6 h時間點,HSP70量的變化與HSF1的變化是大致平行的,所以推測熱休克反應對皮瓣組織細胞的保護作用可能是:HSF1活化;HSP70轉錄、翻譯程度的增強;HSP70具有分子伴侶作用,能穩(wěn)定細胞膜;保護細胞蛋白質,促進糖轉運,貯備等作用,而且在清除異常蛋白促進細胞修復中,HSP70也具有很重要的作用。熱應激預處理通過激發(fā)和扶持機體內(nèi)源性的抗損傷能力,從而保護組織、細胞,促進其修復,所以在臨床應用中有較為重要的價值。HSP70及HSF1作為一種生物機體受刺激時產(chǎn)生的,具有保護細胞功能的蛋白質,應該為熱應激預處理保護機制的物質基礎之一。在這個實驗中對HSF1和HSP70在皮瓣保護的作用進行初步的探討,推斷HSP70、HSF1在皮瓣的延遲保護作用中扮演重要的角色,為今后的臨床應用提供理論依據(jù)。

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