黃遠(yuǎn)見 ,肖 娟 ,張志偉 ,羅志強(qiáng)

(1.南華大學(xué)附屬第二醫(yī)院耳鼻咽喉科,湖南衡陽421001;2.南華大學(xué)腫瘤研究所)

研究顯示,miR-34a在結(jié)直腸癌、前列腺癌、肝癌、肺癌、膠質(zhì)瘤等腫瘤組織和細(xì)胞中表達(dá)下調(diào),且過表達(dá)miR-34a能抑制多種腫瘤的生長、侵襲與轉(zhuǎn)移,在腫瘤的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮著重要作用[1-2]。上調(diào)miR-34a的表達(dá)可通過靶向抑制 Bcl-2、E2F3、CD44、SIRT1抑制乳腺癌細(xì)胞增殖,侵襲以及誘導(dǎo)乳腺癌細(xì)胞凋亡,抑制裸鼠成瘤能力并可延長乳腺癌荷瘤小鼠的生存時間[3-4],這些結(jié)果均表明miR-34a在一些腫瘤中是一個具有抑瘤功能的miRNA。本課題組采用MTT、細(xì)胞劃痕、Transwell以及流式細(xì)胞術(shù)(PI/AnnexinⅤ)等技術(shù),首次分析 miR-34a在人鼻咽癌CNE2細(xì)胞中的生物學(xué)行為,為進(jìn)一步探討鼻咽癌發(fā)生發(fā)展的分子機(jī)制提供實(shí)驗(yàn)依據(jù),為鼻咽癌的防治提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

人鼻咽癌株CNE2細(xì)胞:南華大學(xué)腫瘤研究所;Lipofectamine 2000脂質(zhì)體:美國 Invitrogen公司;miR-34a mimics、negative control:廣州市銳博生物科技有限公司;Annexin V-FITC/PI試劑盒:南京凱基生物科技發(fā)展有限公司;MTT:美國Sigma公司。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) 人鼻咽癌細(xì)胞株CNE2細(xì)胞用含10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基培養(yǎng)在37℃、5%CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)。培養(yǎng)細(xì)胞呈單層貼壁生長,傳代時細(xì)胞匯合度達(dá)80% ～90%左右。先傾棄培養(yǎng)液,PBS洗3遍,0.25%胰酶消化,顯微鏡下見細(xì)胞間隙增大后,傾去胰酶,用含10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基吹打細(xì)胞使其成單細(xì)胞懸液,常規(guī)傳代。

1.2.2 MTT法 用PBS緩沖液洗滌預(yù)先培養(yǎng)至80%左右匯合度的細(xì)胞3次,0.25%胰酶消化,取200 μL即1×104個細(xì)胞接種于96孔板中,設(shè)復(fù)孔5個。37℃、5%CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h,細(xì)胞達(dá)到90%匯合度左右。每孔加滅菌MTT液(5 mg/mL)20 μL,繼續(xù)孵育4 h后終止培養(yǎng),小心吸棄每孔中的上清液,每孔中加入150 μL DMSO,低速振蕩10 min至使結(jié)晶物充分融解。選擇波長為570 nm,在酶標(biāo)儀上檢測各孔吸光值,記錄結(jié)果,實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.2.3 劃痕實(shí)驗(yàn) 將細(xì)胞接種于6孔板中培養(yǎng)至臨近飽合,吸凈上層培養(yǎng)液,用PBS緩沖液洗滌2遍,用消毒后的10 μL Eppendorf Tip在細(xì)胞板上劃痕,并將細(xì)胞輕洗2遍。加入含10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基2 mL至培養(yǎng)板中,倒置顯微鏡下觀察各組細(xì)胞0、12、24 h的劃痕距離,并于倒置顯微鏡下攝像。

1.2.4 Transwell侵襲實(shí)驗(yàn) 將Matrigels基質(zhì)膠從-20℃冰箱放置4℃充分融解。在8 μm的transwell小室中鋪加用預(yù)冷的無血清RPMI-1640培養(yǎng)基按說明稀釋的基質(zhì)膠,37℃培養(yǎng)箱中過夜以成膜。在transwell小室的上室中加入無血清RPMI-1640培養(yǎng)基100 μL水化基質(zhì)膠20 min。用無血清RPMI-1640培養(yǎng)基稀釋并制成1×106個/mL的細(xì)胞懸液,取100 μL即每孔1×105個/mL接種至transwell小室的上室,然后在transwell小室的下室中加入含10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基500 μL。37℃、5%CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)30 h。取出transwell小室,終止培養(yǎng),0.1%結(jié)晶祡染色液,將小室放置于24孔板中染色20 min,PBS緩沖液洗盡結(jié)晶紫,風(fēng)干后中性樹膠封片。隨機(jī)選取4個視野計(jì)算細(xì)胞總數(shù),取平均值,實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.2.5 Annexin V-FITC/PI檢測細(xì)胞凋亡 消化細(xì)胞離心收集;用PBS洗滌細(xì)胞2次;收集1～5×105細(xì)胞;加入100 μL的結(jié)合緩沖液懸浮細(xì)胞;加入5 μL Annexin V-FITC 混勻后;加入 1 μL PI,混勻;室溫、避光、反應(yīng)15～30 min,進(jìn)行流式細(xì)胞儀檢測;激發(fā)波長488 nm;發(fā)射波長530 nm;熒光補(bǔ)償調(diào)節(jié)后進(jìn)行流式分析。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS 16.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。所有數(shù)據(jù)均以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示。兩組間比較用t檢驗(yàn),多組間比較用單因素方差分析,P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 MTT檢測miR-34a對人鼻咽癌CNE2細(xì)胞生長的影響

本研究化學(xué)合成 miR-34a mimics及其對照(miRNA無關(guān)序列,scramble),通過轉(zhuǎn)染過夜后,將CNE2細(xì)胞以1×104個的密度接種于96孔板,每隔24 h在酶聯(lián)免疫檢測儀上測定各孔吸光度值,連續(xù)測定3天。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次(圖1)。結(jié)果顯示,在轉(zhuǎn)染 miR-34a mimics 24 h、48 h、72 h后 OD 值分別為(0.44±0.03)、(0.49±0.02)、(0.59±0.03);分別與對照組相應(yīng)時間點(diǎn)[(0.49±0.04)、(0.78±0.03)、(1.19±0.16)]比較,在轉(zhuǎn)染48 h及72 h時,差異均有顯著性(P＜0.05),即過表達(dá)miR-34a可抑制人鼻咽癌CNE2細(xì)胞的生長。

圖1 MTT檢測miR-34a對人鼻咽癌CNE2細(xì)胞生長的影響 與scramble比較,*:P＜0.05

2.2 劃痕實(shí)驗(yàn)檢測miR-34a對人鼻咽癌CNE2細(xì)胞運(yùn)動能力影響

細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)可以檢查細(xì)胞的運(yùn)動能力,轉(zhuǎn)染miR-34a mimics及其對照scramble于過夜細(xì)胞貼壁后進(jìn)行細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn),通過測算0 h與48 h的劃痕愈合率,其愈合率=(0 h劃痕寬度-48 h劃痕寬度)/(0 h劃痕寬度)。結(jié)果顯示,轉(zhuǎn)染 miR-34a mimics 48 h后劃痕愈合率為40.3% ±9.0%,與對照組(76.3% ±6.8%)相比能明顯減緩CNE2細(xì)胞劃痕的愈合(P＜0.01,圖2)。結(jié)果提示,過表達(dá)miR-34a對CNE2細(xì)胞運(yùn)動能力有抑制作用。

圖2 過表達(dá)miR-34a對鼻咽癌CNE2的遷徙侵襲能力影響 A:細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)檢測轉(zhuǎn)染miR-34a的mimics后0h、48 h細(xì)胞之間的劃痕寬度;B:細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)檢測過表達(dá)miR-34a后劃痕愈合統(tǒng)計(jì)分析;C:Transwell侵襲實(shí)驗(yàn)檢測過表達(dá)miR-34a 48 h后穿過基底膜的CNE2細(xì)胞顯微照片(×200);D:過表達(dá)miR-34a 48 h后CNE2細(xì)胞穿出數(shù)量統(tǒng)計(jì)分析

2.3 Transwell侵襲實(shí)驗(yàn)檢測過表達(dá) miR-34a對CNE2細(xì)胞侵襲能力的影響

進(jìn)一步檢測過表達(dá)miR-34a對CNE2細(xì)胞侵襲能力的影響,Transwell上室接種CNE2細(xì)胞,轉(zhuǎn)染miR-34a mimics,接種于24孔板上Transwells小室,48 h后取出Transwells小室固定,結(jié)晶紫染色,用中性樹膠封片,顯微攝影,任意選取4個不同視野的穿出的細(xì)胞進(jìn)行統(tǒng)計(jì),結(jié)果顯示,轉(zhuǎn)染miR-34a mimics 48 h后穿過基底膜的細(xì)胞數(shù)為71±10,與對照組(147±5)比較,能明顯減緩CNE2細(xì)胞侵襲能力(P＜0.05,圖2C～D)。過表達(dá)miR-34a對CNE2細(xì)胞侵襲能力有抑制作用。

3 討 論

鼻咽癌是中國最常見的惡性腫瘤,發(fā)病具有明顯的地區(qū)聚集性,廣東省等華南地區(qū)尤為高發(fā)。世界衛(wèi)生組織材料顯示,40%的鼻咽癌發(fā)生在中國,嚴(yán)重威脅中國人民生命健康。隨著磁共振等現(xiàn)代影像學(xué)技術(shù)、放射治療等精確放射治療技術(shù)的聯(lián)合應(yīng)用,鼻咽癌的局部控制率已經(jīng)提高到93%,但中晚期鼻咽癌的遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移率仍高達(dá)30%,成為鼻咽癌治療失敗的主要模式[5]。

miRNAs包含20～24個核苷酸,它是一類非編碼的小分子單鏈RNAs,具有高度保守性、時間和組織特異性[6]。通過與靶基因mRNA完全或不完全地堿基配對,RNA誘導(dǎo)的沉默復(fù)合物可降解靶mRNA或抑制翻譯,并且在轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)節(jié)靶基因的表達(dá)[7]。miRNAs廣泛存在于真核生物中,調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖、分化和凋亡。特定的miRNAs在不同的腫瘤和不同的階段高表達(dá)或低表達(dá),這意味著與腫瘤的發(fā)生發(fā)展以及預(yù)后具有一定相關(guān)性[8]。進(jìn)一步研究miRNA和鼻咽癌的關(guān)系可能為早期腫瘤的檢測、監(jiān)測、預(yù)后、基因治療以及解決化療抵抗提供新的應(yīng)用價值。迄今為止,對miRNA 34a在鼻咽癌發(fā)生發(fā)展中的研究尚無人涉足[9]。

關(guān)于miR-34a已有很多研究,miR-34a可通過抑制CD44表達(dá)而抑制前列腺癌和前列腺癌干細(xì)胞的再生和轉(zhuǎn)移,從而起到治療前列腺癌的作用[10]。miR-34a可通過抑制c-Myc的表達(dá)從而抑制腎細(xì)胞癌的增殖[11]。Wu等[2]報道m(xù)iR-34a可通過抑制Fra-1的表達(dá)而抑制結(jié)腸癌的遷移和侵襲。本研究通過 MTT、細(xì)胞劃痕、Transwell、PI/AnnexinⅤ結(jié)合FCM發(fā)現(xiàn),過表達(dá)miR-34a可抑制人鼻咽癌CNE2細(xì)胞的生長增殖以及運(yùn)動和侵襲能力,且可誘導(dǎo)CNE2細(xì)胞凋亡,結(jié)果表明miR-34a可在鼻咽癌的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮抑瘤基因的作用。提示miR-34a可能在鼻咽癌發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮重要作用。

miRNA作為瘤基因或抑瘤基因功能的發(fā)現(xiàn)為腫瘤病因及發(fā)病機(jī)制的研究提供了新思路,也為腫瘤的防治、腫瘤的診斷、腫瘤的分子分型、腫瘤的預(yù)后分子以及療效監(jiān)測甚至輔助治療方面如何指導(dǎo)用藥提供了新策略。本課題繼續(xù)深入miR-34a在鼻咽癌中的功能和分子研究,系統(tǒng)闡明miR-34a參與鼻咽癌發(fā)生發(fā)展的可能分子機(jī)制,為鼻咽癌的防治提供理論依據(jù)和實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

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