歐陽德亮 ,胡 楊 ,王又保 ,黃明明 ,謝榮兵

(1.南華大學(xué)附屬第三醫(yī)院普外科,湖南衡陽421900;2.南華大學(xué)附屬南華醫(yī)院消化內(nèi)科)

胃癌是我國最常見的消化系統(tǒng)惡性腫瘤之一。跟其他腫瘤類似,也是一個(gè)多因素、多步驟、多階段的復(fù)雜過程,涉及到宿主體內(nèi)的基因型以及表型的變化。雖然早期手術(shù)治療可挽救部分患者的生命,但對(duì)于晚期患者而言,化療依然是主要治療手段。盡管目前用于胃癌化療的藥物眾多,但因副作用等因素限制了其使用。穿心蓮內(nèi)酯(Andrographolide,AD)是一類具有消炎解毒功能的二萜類化合物,以往多用于臨床上各種感染性疾病的治療[1-2]。但近年有研究顯示,這種化合物對(duì)人類多種腫瘤細(xì)胞生長具有一定的抑制效應(yīng)[3]。近年研究顯示,在腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程中,Na+-K+-ATP酶可能參與腫瘤細(xì)胞的增殖[4]。此外,血管內(nèi)皮生長因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)和轉(zhuǎn)化生長因子β1(transforming growth factor-β1,TGF-β1)以及基質(zhì)金屬蛋白酶(matrix metalloproteinase-9,MMP-9)等也廣泛參與癌細(xì)胞的黏附、侵襲及遷移。本研究旨在觀察穿心蓮內(nèi)酯對(duì)胃癌細(xì)胞生長增殖的影響,并初步探討其可能的機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 試劑

穿心蓮內(nèi)酯(純度98%)購自Sigma-Aldrich化學(xué)制品公司,用 DMSO溶解使其成為濃度為15 mmol/L的貯存液。細(xì)胞培養(yǎng)基為Invitrogen產(chǎn)品,培養(yǎng)板購自Corning公司。其他試劑均購于上海生工。Trizol試劑購自Invitrogen公司。RT-PCR試劑盒購自大連寶生物公司。The SensoLyte MMP-9活性檢測(cè)試劑盒購自AnaSpec公司。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)

人胃癌細(xì)胞系A(chǔ)GS用含10%胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)基中在37℃含有5%CO2的環(huán)境下培養(yǎng),其中包含了100單位/mL的青霉素和100單位/mL的鏈霉素(pH 7.4)。每3天更換培養(yǎng)基或進(jìn)行細(xì)胞傳代培養(yǎng)。用于各種實(shí)驗(yàn)和分析的細(xì)胞密度約為105/mL。

1.3 Na+-K+-ATP酶活性分析

根據(jù)酶促反應(yīng)釋放的無機(jī)磷(Pi)的含量反應(yīng)ATP酶的活性。反應(yīng)體系中含有20 mmol/L KCl、100 mmol/L NaCl、30 mmol/L Tris 緩沖液(pH 7.4)以及新鮮細(xì)胞線粒體分離物。當(dāng)反應(yīng)體系加入2 mmol/L ATP后,30℃孵育15 min,接著加入15%三氯乙酸終止反應(yīng)。通過測(cè)量640 nm處的吸光度分析釋放的無機(jī)磷的含量。ATP酶活性的定義:1 mg蛋白質(zhì)1 h內(nèi)催化ATP生成1 μmol/L無機(jī)磷的量為1個(gè)單位ATP酶活性,并計(jì)算其相對(duì)活性,公式為:相對(duì)活性=處理組酶活性/對(duì)照組酶活性×100%。

1.4 細(xì)胞增殖分析

為了檢測(cè)細(xì)胞的生存能力,進(jìn)行MTT分析。利用0.25 mg MTT/mL在37℃下孵育實(shí)驗(yàn)細(xì)胞。利用全自動(dòng)定量繪圖酶標(biāo)儀通過測(cè)量570 nm(630作為參考)下的吸光度。細(xì)胞抑制率=(空白組OD值-處理組OD值)/空白組OD值×100%。

1.5 DNA斷裂的測(cè)量

采用ELISA測(cè)量DNA斷裂情況。細(xì)胞經(jīng)不同濃度的穿心蓮內(nèi)酯孵育之后,室溫下裂解癌細(xì)胞30 min,接著200 g下離心10 min。然后將20 μL上清液轉(zhuǎn)移至抗生蛋白鏈菌素包被的培養(yǎng)板中,并且每孔加入80 μL新配制的免疫試劑,在室溫下孵育2 h。利用PBS沖洗之后,加入底物溶液,并孵育15 min。利用全自動(dòng)定量繪圖酶標(biāo)儀測(cè)量405 nm處的吸光度(參考490 nm的波長)。計(jì)算斷裂DNA的相對(duì)含量=樣本吸光度/對(duì)照組吸光度×100%(樣本:穿心蓮內(nèi)酯處理的細(xì)胞;對(duì)照組:未用穿心蓮內(nèi)酯處理的細(xì)胞)。

1.6 VEGF和TGF-β1水平的測(cè)定

利用不同濃度的穿心蓮內(nèi)酯預(yù)處理細(xì)胞48 h。利用PBS沖洗之后,接著用10 ng/mL的TNF-α孵育樣本18 h。利用ELISA工具測(cè)定VEGF和TGF-β1在細(xì)胞培養(yǎng)上清液中的水平。

1.7 MMP-9活性測(cè)定

細(xì)胞處理結(jié)束后,獲取上清,采用間接法測(cè)定MMP-9的酶活性。其步驟根據(jù) AnaSpec公司的SensoLyte?490 MMP-9 Assay Kit提供的步驟進(jìn)行。本試劑盒含有EDANS/DabcylPlusTM熒光共振能量轉(zhuǎn)移肽,在這條完整的肽當(dāng)中,DabcylPlus將EDANS熒光淬火,而此肽被MMP-9特異性降解后,EDANS重新獲得熒光,在熒光酶標(biāo)儀上測(cè)定其強(qiáng)度(與MMP-9的活性成正比,激發(fā)/發(fā)射波長分別為340 nm和490 nm),并計(jì)算各組與對(duì)照組的比值(相對(duì)活性)。

1.8 侵襲力分析

制備AGS細(xì)胞懸液(3×106/mL),同時(shí)將Matrigel鋪在 Transwell濾膜上(40 μL/孔),紫外照射12 h。Transwell的上室加入細(xì)胞懸液100 μL,下室加入500 μL完全培養(yǎng)基。5%CO2條件下培養(yǎng)24 h。取出小室,甲醇4℃固定10 min,并加入結(jié)晶紫染色5 min,PBS洗滌后擦去上表面細(xì)胞,并隨機(jī)選擇5個(gè)視野,計(jì)算穿膜細(xì)胞數(shù)目。

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示,用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件處理數(shù)據(jù)并進(jìn)行方差分析(ANOVA),組間比較采用LSD分析。P＜0.05為差異有顯著性。

2 結(jié) 果

2.1 不同濃度穿心蓮內(nèi)酯對(duì)Na+-K+-ATP酶活性的影響

不同濃度的穿心蓮內(nèi)酯作用AGS細(xì)胞24 h后,能在一定程度上抑制細(xì)胞內(nèi)Na+-K+-ATP酶活性。其中1.0 μmol/L穿心蓮內(nèi)酯能使酶活性降低至86%,3.0 μmol/L 時(shí)其活性為 59%,而 5.0 μmol/L穿心蓮內(nèi)酯能使Na+-K+-ATP酶活性降低至48%,見圖1所示。

圖1 不同濃度穿心蓮內(nèi)酯對(duì)Na+-K+-ATP酶活性的影響1:對(duì)照組;2:1.0 μmol/L穿心蓮內(nèi)酯;3:3.0 μmol/L穿心蓮內(nèi)酯;4:5.0 μmol/L穿心蓮內(nèi)酯.與對(duì)照組(0 μmol/L)比較,*:P＜0.05

2.2 穿心蓮內(nèi)酯對(duì)AGS細(xì)胞生長增殖的影響

MTT結(jié)果顯示,在同一時(shí)間點(diǎn),不同濃度的穿心蓮內(nèi)酯能有效抑制AGS細(xì)胞生長增殖,且隨著濃度的增高抑制作用增強(qiáng)。在相同濃度作用下,隨作用時(shí)間的延長,對(duì)AGS細(xì)胞的抑制作用越明顯(表1)。

表1 穿心蓮內(nèi)酯在不同濃度及不同時(shí)間作用下對(duì)AGS細(xì)胞抑制率的影響(%)

2.3 穿心蓮內(nèi)酯對(duì)斷裂DNA含量的影響

如圖2所示,1.0 μmol/L穿心蓮內(nèi)酯孵育48 h后能輕微增加斷裂DNA的含量。隨著濃度的增高,其斷裂DNA含量隨之增多。

圖2 不同濃度穿心蓮內(nèi)酯對(duì)斷裂DNA含量的影響 1:對(duì)照組;2:1.0 μmol/L穿心蓮內(nèi)酯;3:3.0 μmol/L穿心蓮內(nèi)酯;4:5.0 μmol/L穿心蓮內(nèi)酯.與對(duì)照組(0 μmol/L)比較,*:P ＜0.05

2.4 穿心蓮內(nèi)酯對(duì)AGS細(xì)胞中VEGF及TGF-β1含量的影響

ELISA結(jié)果顯示,隨著穿心蓮內(nèi)酯濃度的增高,VEGF和TGF-β1的水平逐漸降低(P＜0.05,表2)。

表2 不同濃度穿心蓮內(nèi)酯對(duì)AGS細(xì)胞中VEGF及TGF-β1水平的影響

2.5 穿心蓮內(nèi)酯對(duì)AGS細(xì)胞MMP-9酶活性的影響

MMP-9間接酶活性結(jié)果顯示,1.0、3.0、5.0 μmol/L穿心蓮內(nèi)酯處理后,與對(duì)照組相比,MMP-9活性明顯降低。其中5.0 μmol/L穿心蓮內(nèi)酯能將MMP-9的酶活性降低47.5%,見圖3。

2.6 穿心蓮內(nèi)酯對(duì)AGS細(xì)胞侵襲的影響

不同濃度穿心蓮內(nèi)酯作用AGS細(xì)胞6 h后,對(duì)細(xì)胞侵襲力的影響見圖4和表3所示,1.0～5.0 μmol/L穿心蓮內(nèi)酯均能不同程度降低AGS細(xì)胞的侵襲力(P＜0.05)。

圖3 不同濃度穿心蓮內(nèi)酯對(duì)MMP-9活性的影響 1:對(duì)照組;2:1.0 μmol/L 穿心蓮內(nèi)酯;3:3.0 μmol/L 穿心蓮內(nèi)酯;4:5.0 μmol/L穿心蓮內(nèi)酯.與對(duì)照組(0 μmol/L)比較,*:P ＜0.05

圖4 穿心蓮內(nèi)酯對(duì)AGS細(xì)胞侵襲力的影響(×20)A:0 μmol/L 穿心蓮內(nèi)酯;B:1.0 μmol/L 穿心蓮內(nèi)酯;C:3.0 μmol/L穿心蓮內(nèi)酯;D:5.0 μmol/L穿心蓮內(nèi)酯

表3 穿心蓮內(nèi)酯對(duì)AGS細(xì)胞侵襲力的影響

3 討 論

誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡是癌癥治療的目標(biāo),而DNA斷裂是細(xì)胞凋亡的重要指標(biāo)。本研究發(fā)現(xiàn)1.0～5.0 μmol/L的穿心蓮內(nèi)酯處理后可顯著增加胃癌細(xì)胞斷裂DNA的含量,可能是由于穿心蓮內(nèi)酯滲入胃癌細(xì)胞后破壞了質(zhì)膜的完整性,最終引起細(xì)胞凋亡。Na+-K+-ATP酶為三羧酸循環(huán)的關(guān)鍵酶,是由一個(gè)α-亞單位和一個(gè)β-亞單位組成的異二聚體。而α-亞單位是一種跨膜蛋白,可用于細(xì)胞內(nèi)Na+和細(xì)胞外K+的交換。因此,Na+-K+-ATP酶對(duì)于維持離子動(dòng)態(tài)平衡很關(guān)鍵[5]。若外源性誘導(dǎo)該酶功能異常,則可觸發(fā)線粒體膜的瓦解而促進(jìn)細(xì)胞凋亡的發(fā)生。有研究發(fā)現(xiàn)抑制Na+-K+-ATP酶的活性,能有效抑制腫瘤細(xì)胞的增殖、侵襲及轉(zhuǎn)移,其機(jī)制可能通過改變?chǔ)?亞單位的穩(wěn)定性而影響線粒體功能,最終導(dǎo)致凋亡的發(fā)生[6]。VEGF和TGF-β1是腫瘤發(fā)生發(fā)展過程中的血管生成因子。TGF-β1是包括胃癌在內(nèi)的一種重要腫瘤生長調(diào)節(jié)物質(zhì)[7-8]。研究表明,TGF-β1通過它的免疫抑制效應(yīng)從而增強(qiáng)胃癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)移[9]。本研究顯示經(jīng)穿心蓮內(nèi)酯處理后,VEGF和TGF-β1在胃癌細(xì)胞中含量明顯降低,這表明穿心蓮內(nèi)酯可能在一定程度上減弱胃癌細(xì)胞中血管生成和纖維發(fā)生。癌細(xì)胞的侵襲和遷移是癌癥復(fù)發(fā)及遷移的關(guān)鍵進(jìn)程。此轉(zhuǎn)移過程與MMP-9的活性密切相關(guān)。MMP-9是一種內(nèi)肽酶,可降解細(xì)胞外基質(zhì)成分,使得癌細(xì)胞進(jìn)入脈管和淋巴系統(tǒng)[10],因此其在腫瘤中的作用已經(jīng)日益受到重視[11]。本研究證實(shí),穿心蓮內(nèi)酯能顯著抑制MMP-9的活性,最終減弱胃癌細(xì)胞的侵襲和遷移。

總之,濃度為1.0～5.0 μmol/L的穿心蓮內(nèi)酯能抑制Na+-K+-ATP酶的活性,從而可能誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的發(fā)生。此外,這種二萜化合物也能抑制VEGF和TGF-β1的產(chǎn)生并抑制MMP-9的活性,從而可能抑制血管的發(fā)生以及減少胃癌細(xì)胞的侵襲。盡管這些結(jié)果說明穿心蓮內(nèi)酯可引起細(xì)胞凋亡或延緩胃癌的遷移,但是該藥物對(duì)于緩和胃癌進(jìn)展的效應(yīng)、作用方式以及適當(dāng)?shù)膭┝?還需要進(jìn)行進(jìn)一步的體內(nèi)研究。

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