(南華大學(xué)附屬第二醫(yī)院眼科,湖南衡陽421001)

目前,糖尿病已成為嚴(yán)重影響人類健康的常見疾病之一,全球糖尿病患者約為3.70億,中國患者已接近1億,其并發(fā)癥涉及器官組織較多,如眼、腎、心、血管、神經(jīng)等,對人們的生活質(zhì)量影響巨大,其中最易導(dǎo)致失明的眼部并發(fā)癥就是糖尿病性白內(nèi)障和糖尿病性視網(wǎng)膜病變[1],糖尿病性白內(nèi)障最主要的發(fā)病機制之一就是氧化應(yīng)激。研究已經(jīng)表明,在白內(nèi)障的形成和發(fā)展中伴隨著晶狀體上皮細胞的凋亡,而過度的氧化應(yīng)激反應(yīng)可加速晶狀體上皮細胞的凋亡[2]。最近的研究表明,金櫻子能清除超氧陰離子自由基,羥自由基,抑制細胞凋亡,阻止脂質(zhì)過氧化,降低血清β2脂蛋白和膽固醇,降低肝臟,心臟脂肪沉積,調(diào)節(jié)血糖,具有顯著的抗氧化和抗炎作用[3],可以在一定程度上延緩大鼠糖尿病腎臟功能的損害[4]。該課題通過研究金櫻子對大鼠糖尿病性白內(nèi)障細胞凋亡和氧化應(yīng)激的影響,探討糖尿病性白內(nèi)障的防治新途徑。

1 材料與方法

1.1 試劑與大鼠

金櫻子從衡陽中藥材公司購買;STZ、碘化丙啶從美國Sigma公司購買;膜聯(lián)蛋白V凋亡檢測試劑盒從美國BD公司購買;丙二醛(MDA)檢測試劑盒、超氧化物歧化酶(SOD)檢測試劑盒和總抗氧化能力檢測試劑盒(TAC)從南京建成生物工程研究所購買;其余試劑均從上海生物工程有限公司購買。Sprague Dawley(SD)大鼠從南華大學(xué)實驗動物部購買,大鼠重量為250±5 g,經(jīng)散瞳實驗檢查顯示晶狀體均正常透明。

1.2 方法

1.2.1 糖尿病大鼠白內(nèi)障模型的建立與金櫻子干預(yù) 將60只SD大鼠腹腔注射鏈脲佐菌素(60 mg/kg),72 h后尾靜脈取血測量空腹血糖大于14 mmoL/L表示糖尿病模型建立成功,然后將成模的大鼠再隨機分為糖尿病模型組和金櫻子干預(yù)組,每組各30只。同時設(shè)立正常對照組SD大鼠30只。金櫻子干預(yù)組按400 mg/kg體重用金櫻子灌胃,4周、8周和12周,每組各取10只大鼠,經(jīng)0.01 g/L戊巴比妥鈉麻醉處死后取晶狀體備用。

1.2.2 血糖與血脂檢測 處死大鼠前,禁食(不禁水)10 h,稱體重,末次給藥后1 h,麻醉大鼠,取腹主動脈血,離心分離血清,檢測血糖、血脂水平用半自動生化分析儀。

1.2.3 晶狀體混濁度檢測 用1%復(fù)方托吡卡胺眼液在大鼠雙眼各點1次,5 min后乙醚蒸氣麻醉,每4周用TOPCON SL-2G裂隙燈顯微鏡觀察晶狀體變化,根據(jù)Azuma等[5]的分級標(biāo)準(zhǔn),將晶狀體混濁水平分為5個等級,Ⅰ級:無混濁,晶體透明;Ⅱ級:輕度混濁,周邊部分晶體皮質(zhì)開始出現(xiàn)空泡樣改變;Ⅲ級:中度混濁,周邊部的空泡樣改變開始向中央發(fā)展,晶體核開始出現(xiàn)少量的霧樣混濁;Ⅳ級:重度混濁,晶體的空泡樣改變范圍繼續(xù)擴大并向晶體核區(qū)蔓延,出現(xiàn)嚴(yán)重的霧狀混濁;Ⅴ級:晶體皮質(zhì)及核全部混濁。

1.2.4 分光光密度法檢測 麻醉處死大鼠后,將大鼠的晶狀體摘除,0.9%氯化鈉注射液沖洗后稱重,然后將晶狀體組織勻漿,低溫離心,取上清液,參照試劑盒說明書,分光光度法檢測晶狀體組織中TAC、MDA活性和SOD含量。

1.2.5 流式細胞儀檢測晶狀體上皮細胞凋亡 獲取大鼠晶狀體,顯微鏡下撕取晶狀體前囊膜,并用300目濾網(wǎng)制備成單細胞懸液,1 000 r/min離心5 min后,PBS洗滌2次,調(diào)整細胞密度為1×109/L。加入預(yù)冷的1×結(jié)合緩沖液、Annexin V-FITC液5 μL和 PI 10 μL,充分混勻,室溫避光染色 15 min,PBS洗滌多余染料后,用流式細胞儀(y=488 nm)檢測細胞凋亡率。

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析

實驗數(shù)據(jù)均平行測定3次,用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示,所有數(shù)據(jù)采用SPSS13.0統(tǒng)計軟件進行分析,晶狀體混濁程度用H檢驗,計量資料組間比較采用單因素方差分析及q檢驗,以P＜0.05表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 糖尿病大鼠的一般情況

大鼠注射STZ后1周,其喝水量、進食量及尿量均顯著增加。正常對照組大鼠體重迅速增加,但金櫻子干預(yù)組和糖尿病模型組體重增長緩慢。4周后糖尿病模型組大鼠精神不振、體重減輕、毛發(fā)干枯與脫毛,糖尿病的并發(fā)癥開始逐步顯現(xiàn)反應(yīng)遲鈍和多發(fā)感染等。稱重發(fā)現(xiàn),金櫻子干預(yù)組體重明顯較糖尿病模型組增加(表1,P＜0.05),一般情況明顯好于糖尿病模型組。12周時糖尿病模型組大鼠體重明顯低于正常對照組和金櫻子干預(yù)組(P＜0.05)。

表1 不同時間各組大鼠的體重變化(g,n=10)

2.2 血糖與血脂

正常對照組大鼠血糖值一直正常。用STZ誘發(fā)后3天,60只大鼠血糖均＞14 mmol/L,與注射前相比血糖明顯升高(P＜0.05)。誘發(fā)4周后,金櫻子干預(yù)組大鼠血糖與血脂明顯下降,而糖尿病模型組血糖與血脂繼續(xù)上升(P＜0.05);至12周時,金櫻子干預(yù)組大鼠血糖與血脂較糖尿病模型組大鼠明顯降低(表2,P＜0.05)。

表2 各組大鼠FBG、TC、TG的變化(mmol/L,n=10)

2.3 晶狀體混濁程度

正常對照組大鼠晶狀體在4～12周內(nèi)一直保持透明,糖尿病模型組、金櫻子干預(yù)組大鼠在注射STZ后第4周均逐漸出現(xiàn)不同程度的晶狀體混濁;到12周時,糖尿病模型組大鼠大部分都出現(xiàn)了比較嚴(yán)重的晶狀體皮質(zhì)及核的混濁,少部分的晶狀體還出現(xiàn)了全白色的混濁,但金櫻子干預(yù)組大鼠發(fā)生晶狀體混濁的數(shù)量及程度均較糖尿病模型組低(圖1,P＜0.05)。

圖1 晶體混濁程度分級(Ⅰ～Ⅴ級) A:Ⅰ級;B:Ⅱ級; C:Ⅲ級; D:Ⅳ級; E:Ⅴ級

2.4 晶狀體組織中TAC、SOD活性和MDA含量

與正常對照組比較,糖尿病模型組大鼠晶狀體組織MDA含量顯著增加,TAC和SOD活性則顯著降低(表3,P＜0.05);經(jīng)金櫻子處理后,不但顯著降低了晶狀體組織的MDA含量,而且明顯增強了TAC和SOD的活性(見表3,P＜0.05)。說明金櫻子能夠降低脂質(zhì)過氧化物,提高晶狀體組織抗氧化酶活性,提高總抗氧化力,從而降低晶狀體的氧化應(yīng)激反應(yīng)的影響,延緩糖尿病性白內(nèi)障的發(fā)生和發(fā)展。

表3 第12周時各組晶狀體組織中TAC、SOD活性 和MDA含量(n=20)

2.5 細胞凋亡率

4周、8周和12周時糖尿病模型組細胞凋亡率均顯著高于正常對照組(見表4,P＜0.05);金櫻子干預(yù)組細胞凋亡率較糖尿病模型組顯著降低(見表4,P＜0.05)。

表4 各組LECs的凋亡率比較(%,n=20)

3 討 論

糖尿病性白內(nèi)障是多種因素綜合作用的結(jié)果,其經(jīng)典發(fā)病機制包括氧化應(yīng)激學(xué)說、滲透壓學(xué)說以及晶體蛋白的非酶糖基化學(xué)說,在各種導(dǎo)致白內(nèi)障的病因中都有一個相同的途徑即由自由基介導(dǎo)的氧化應(yīng)激[6]。生理條件下,晶狀體有兩類自由基防御系統(tǒng):酶防御系統(tǒng)(超氧化物歧化酶(SOD),過氧化氫酶(CAT),谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-PX)及其同工酶CuZnSOD等);另一個是非酶防御系統(tǒng)(維生素C、E和巰基化合物等,它的主要功能是保護晶狀體蛋白巰基功能、減少H2O2和其他氧化物生成[7])。主要用于清除自由基、維持細胞和機體的正常生理功能。抗氧化防御屏障受很多因素的影響,一旦受損可以導(dǎo)致谷胱甘肽(GSH)、抗壞血酸,維生素C和E等的含量減少,抗氧化酶(GSH-PX、CAT、SOD)活力降低,使晶體 O2-、OH-、H2O2等自由基清除率降低或生成量增加,使晶狀體的上皮細胞和纖維細胞發(fā)生凋亡,蛋白質(zhì)和脂質(zhì)發(fā)生過氧化最終導(dǎo)致白內(nèi)障的形成[8]。超氧化物歧化酶是晶狀體內(nèi)抗氧化的關(guān)鍵物質(zhì),現(xiàn)已證實:糖尿病發(fā)生時,當(dāng)SOD、CAT、GSH-PX活力明顯降低時有大量OH-、O2-和H2O2等活性氧自由基產(chǎn)生,其源自葡萄糖與蛋白質(zhì)發(fā)生糖基化作用后葡萄糖的自氧化過程,因此,有學(xué)者認為自由基引起的過度的氧化應(yīng)激反應(yīng)是引發(fā)糖尿病性白內(nèi)障的主要原因[9]。TAC衡量的是機體或組織內(nèi)總的抗氧化能力的大小,SOD是酶促防御系統(tǒng)中的關(guān)鍵酶,它既是一種抗氧化劑,又不同于一般的抗氧化劑,它是機體自身產(chǎn)生的一種特殊的抗氧化酶,其作用遠遠大于一般的抗氧化劑,大約是一般抗氧化劑的1000倍以上,對其含量的測定可以反映出機體自身抗氧化能力的大小。MDA是氧化應(yīng)激反應(yīng)的一種標(biāo)志性產(chǎn)物,它是脂質(zhì)在自由基作用下產(chǎn)生氧化應(yīng)激反應(yīng)所生成的產(chǎn)物,且具有細胞毒性,通常用來評價機體氧化應(yīng)激水平,因此,MDA含量越高說明氧化應(yīng)激反應(yīng)就越強。

晶狀體上皮細胞在晶狀體透明性的保護方面有著非比尋常的意義,當(dāng)晶狀體上皮細胞凋亡達到一定的數(shù)量,細胞增生和凋亡失衡導(dǎo)致晶狀體混濁的發(fā)生,國內(nèi)外學(xué)者較為一致的觀點是晶狀體上皮細胞的凋亡是年齡相關(guān)性白內(nèi)障、代謝性白內(nèi)障以及外傷性白內(nèi)障等形成的細胞學(xué)基礎(chǔ)[10]。已有研究顯示,在高血糖的環(huán)境下,晶狀體內(nèi)環(huán)境代謝失衡,高糖產(chǎn)生的氧化應(yīng)激、高滲透壓等損害因子會增加更快,破壞晶狀體的穩(wěn)定,攻擊晶狀體上皮細胞,破壞晶狀體上皮細胞增生和凋亡的平衡,使晶狀體上皮細胞加速凋亡,最終導(dǎo)致白內(nèi)障[11]。

中草藥金櫻子(Rosa Laevigata Mickx)屬薔薇科薔薇屬的常綠蔓性灌木,其果實中富含幾十種生理活性物質(zhì)[12],如維生素、氨基酸、多糖、黃酮類、三萜類等。已有研究發(fā)現(xiàn)金櫻子除了可以大幅降低血清膽固醇、甘油三脂和β脂蛋白,還能消炎,保肝護腎,固本培元,止尿及抗衰老,金櫻子中的多糖類和黃酮類化合物能明顯清除肝腎等組織中OH-、O2-等超氧自由基,有明顯的抗氧化和抑制細胞凋亡的作用[13-14]。目前,金櫻子對糖尿病性白內(nèi)障是否具有防治作用尚無研究報告。

本研究結(jié)果證實,在實驗的12周內(nèi)糖尿病大鼠隨著病情的發(fā)展,晶狀體混濁發(fā)展的同時晶狀體上皮細胞凋亡率也在相應(yīng)的增加。然而,經(jīng)過金櫻子處理后的大鼠,LEC凋亡水平明顯低于糖尿病模型組,說明金櫻子能在一定程度上抑制或延緩了凋亡的發(fā)生。

本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn),糖尿病模型組大鼠與正常對照組比較,一方面晶狀體組織中MDA含量顯著增加,另一方面SOD、TAC活性顯著減弱,經(jīng)金櫻子處理后的糖尿病大鼠晶狀體組織中MDA含量顯著降低,SOD、TAC活性顯著增強。研究結(jié)果表明,金櫻子可以降低晶狀體組織中脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物的生成,提高抗氧化酶的活性和總抗氧化能力,減輕晶狀體的氧化應(yīng)激反應(yīng),起到保護晶狀體維持透明性的作用。本實驗發(fā)現(xiàn),從成模后的第4周開始糖尿病模型組大鼠晶狀體混濁度均顯著高于另外兩組(P＜0.05),經(jīng)金櫻子處理后的大鼠晶狀體混濁度發(fā)展速度則顯著低于糖尿病模型組(P＜0.05)。

綜上所述,本研究從晶狀體的形態(tài)學(xué)、生物酶學(xué)及細胞學(xué)三個方面初步研究了金櫻子對糖尿病大鼠晶狀體的保護作用,結(jié)果發(fā)現(xiàn)金櫻子對糖尿病性白內(nèi)障大鼠晶狀體上皮細胞凋亡具有一定的抑制功能,并可能與其具有較強的抗氧化能力,最終通過抑制晶狀體組織的氧化應(yīng)激而實現(xiàn)治療糖尿病性白內(nèi)障的作用。因此,金櫻子有望成為糖尿病性白內(nèi)障治療的一種潛在藥物,但其具體的調(diào)控機制還有待進一步研究,同時,對于金櫻子中最有效的抗氧化成分的研究還有待深入研究。

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