(南華大學(xué)病原生物研究所,湖南衡陽421001)

鸚鵡熱嗜衣原體(Chlamydophila psittaci,Cps)是一種嚴格細胞內(nèi)寄生、多宿主性的人獸共患病病原體,能引起人、哺乳動物、鳥類呼吸道感染等多種疾病[1-2]。Cps感染后可致肺炎、關(guān)節(jié)炎、淋巴瘤等多種疾病[3]。由于Cps的細胞內(nèi)寄生性常引起隱性、持續(xù)性的感染以及長期使用抗生素所造成的耐藥性增加等因素,使得感染反復(fù)遷延,造成進行性、不可逆的病理損傷。到目前為止,Cps的致病機制尚不清楚。有研究報道,衣原體產(chǎn)生的效應(yīng)蛋白與宿主細胞的相互作用是衣原體致病過程中必不可少的環(huán)節(jié)[3-4]。本研究采用DNA重組技術(shù)構(gòu)建pET30a-CPSIT_0018原核表達載體,后將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到E.coli BL21中,誘導(dǎo)蛋白表達并對表達的蛋白進行純化,免疫小鼠制備多克隆抗體,間接免疫熒光法分析His-CPSIT_0018蛋白在Hela細胞中的分布特征,為進一步研究Cps的致病機制奠定理論和實驗基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 菌株、動物、細胞株和主要試劑

Cps 6BC菌株由美國德克薩斯大學(xué)圣安東尼奧健康科學(xué)中心(UTHSCSA)鐘光明教授實驗室提供;清潔級4～6周齡雌性健康BALB/c小鼠購于湖南斯萊克景達實驗動物有限公司;HeLa細胞購自上海中科院細胞庫。

DNA聚合酶、dNTP Mix、限制性內(nèi)切酶BamH I和Not I、T4連接酶均購自 Promega公司,Ni-NTA Agarose購自Qiagen公司,細菌DNA提取試劑盒、PCR產(chǎn)物純化試劑盒、DNA marker、蛋白質(zhì) marker、HRP標(biāo)記羊抗小鼠IgG購自碧云天生物公司,鼠抗MOMP多克隆抗體、鼠抗InA多克隆抗體、Cy3標(biāo)記的羊抗鼠IgG和Cy2標(biāo)記的羊抗兔IgG均來自美國鐘光明教授所在的實驗室,DMEM培養(yǎng)基購自Invitrogen公司,胎牛血清購自 Gibco公司,CPSIT_0018 引物(上游 5′-CGC GGA TCC ATG GTT AAT CCT GTT GGT CCT-3′,下游 5′-TTT TCC TTT TGC GGC CGC TTA CTG TAG GTA TCC GGA GAA-3′)由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

1.2 pET30a-CPSIT_0018原核表達載體的構(gòu)建及鑒定

以Cps 6BC基因組DNA為模板,PCR擴增CPSIT_0018基因;擴增產(chǎn)物經(jīng)1.5%(W/V)瓊脂糖電泳鑒定PCR產(chǎn)物;應(yīng)用PCR產(chǎn)物純化試劑盒純化回收PCR產(chǎn)物,純化產(chǎn)物和pET30a質(zhì)粒經(jīng)BamH I和NotI進行雙酶切,純化后用T4 DNA連接酶于22℃連接3 h,再將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化到E.coli BL21中,卡那霉素抗性平板篩選轉(zhuǎn)化成功的菌株,挑取單個菌落進行PCR鑒定及序列測定(上海Invitrogen公司)。

1.3 CPSIT_0018融合蛋白的表達與純化

將鑒定后的陽性單克隆接種于2 mL抗性(含60 μg/mL卡那霉素)LB培養(yǎng)液中,37℃水浴,220 rpm振蕩培養(yǎng)過夜。次日以1∶100的比例擴大培養(yǎng);4 h后加入IPTG(終濃度為0.25 mmol/L)30℃水浴,180 rpm振蕩誘導(dǎo)表達,4 h后離心收集細菌,超聲破菌后高速離心,上清用Ni-NTA層析法過柱純化蛋白,依次收集到首次流出液、第1次洗滌液(洗滌液1)、第2次洗滌液(洗滌液2)、第3次洗滌液(洗滌液3)、第1次洗脫液(洗脫液1)、第2次洗脫液(洗脫液2),依次類推。各種液體經(jīng)12%SDS-PAGE電泳和考馬斯亮藍染色分析,觀察其表達情況和純化效果。

1.4 免疫動物

取4～6周齡BALB/c小鼠6只,空白組合實驗組各3只,每只小鼠以100 μg重組蛋白(約50 μL)與等體積的完全弗氏佐劑經(jīng)超聲乳化后,行小鼠皮下注射,初次免疫后的第20天和第28天,再以每只小鼠100 μg重組蛋白與等體積的不完全弗氏佐劑超聲乳化后進行第2次和第3次免疫,空白對照組用PBS替代蛋白。小鼠在每次免疫前尾靜脈采血,最后1次免疫后1周摘眼球取血,以2 000 rpm離心20 min分離血清,分離的血清與空載體轉(zhuǎn)化菌的誘導(dǎo)表達產(chǎn)物等體積混合完全后,37℃孵育過夜,14 000 rpm離心20 min,取上清作為吸附純化的多克隆抗體。

1.5 ELISA測定抗體的滴度

用PBS稀釋純化的重組蛋白His-CPSIT_0018至10 μg/mL,每空100 μL 蛋白包被酶標(biāo)板,37 ℃孵育1 h后置4℃過夜,5%脫脂牛奶室溫封閉2 h,0.1%PBST洗板5次,加入倍比稀釋的不同濃度的待測免疫血清100 μL,37℃孵育1 h,PBST洗板5次后分別加入1∶2 000稀釋的 HRP標(biāo)記的羊抗小鼠 IgG 100 μL孵育30 min,再同樣方法PBST洗板5次,加入 TMB顯色劑 100 μL,37℃避光反應(yīng)10 min,最后用終止液100 μL/孔終止反應(yīng),酶標(biāo)儀讀取405 nm波長的OD值。

1.6 細胞培養(yǎng)

HeLa細胞培養(yǎng)于含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基中,37℃、5%CO2的恒濕恒溫培養(yǎng)箱中孵育,待細胞密度在1.0～1.5×106/mL時,呈單層生長鋪滿培養(yǎng)瓶80%左右后,用胰酶消化進行細胞傳代,接種于24孔板內(nèi)。

1.7 間接免疫熒光法(IFA)對CPSIT_0018進行定位分析

取合適稀釋度的Cps6BC型稀釋液感染24孔板蓋玻片上的Hela細胞(細胞融合度約為60%左右),37℃繼續(xù)培養(yǎng)48 h,然后用4%多聚甲醛固定30 min,0.3%Triton X-100室溫處理10 min使其膜通透性增加,PBS洗滌和牛奶封閉后,以鼠抗CPSIT_0018多克隆抗體和兔抗Cps 6BC型全菌抗體為一抗,以Cy3標(biāo)記的羊抗鼠IgG(紅色)和Cy2標(biāo)記的羊抗兔IgG(綠色)為二抗,同時用Hoechst(藍色)標(biāo)記DNA進行免疫熒光檢測。同時設(shè)立MOMP、InA作為定位參考。

2 結(jié) 果

2.1 CPSIT_0018基因的PCR擴增

PCR擴增Cps 6BC基因組中的CPSIT_0018基因,將PCR擴增產(chǎn)物于1.5% 瓊脂糖凝膠電泳,結(jié)果如圖1所示,在1 200 bp和2 000 bp位置可見一條清晰的特異性條帶,與預(yù)期片段(1 920 bp)接近。

圖1 CPSIT_0018基因PCR擴增產(chǎn)物圖 1:DNA Marker;2:CPSIT_0018基因PCR擴增產(chǎn)物

2.2 CPSIT_0018重組蛋白的表達與純化

將pET30a-CPSIT_0018重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至E.coli BL21,0.25 mmol/L IPTG誘導(dǎo)其表達。SDS-PAGE結(jié)果顯示:誘導(dǎo)菌在Mr約為87 kDa處有明顯條帶,與預(yù)期的分子量相符(圖2);經(jīng)His樹脂純化后,在相應(yīng)位置處得到純化的重組蛋白(圖3)。

2.3 His-CPSIT_0018的抗原性分析

將重組蛋白His-CPSIT_0018作為檢測抗原,包被酶標(biāo)板,ELISA法對0、21、28、40天收集的小鼠對照組和實驗組血清中抗His-CPSIT_0018特異性抗體IgG進行檢測,當(dāng)405 nm相對吸光值(實驗組/對照組)大于2為陽性反應(yīng),抗體反應(yīng)呈陽性時的最高血清稀釋度即抗體滴度。結(jié)果顯示CPSIT_0018蛋白可刺激小鼠產(chǎn)生免疫反應(yīng),隨著接種次數(shù)的增多抗體滴度逐漸升高,最高抗體滴度達1∶500 000。

2.4 IFA分析CPSIT_0018在感染的Hela細胞內(nèi)的定位

Cps6BC感染Hela細胞48 h后,IFA結(jié)果顯示包涵體分布(綠色)在HeLa細胞胞漿中,CPSIT_0018蛋白(紅色)定位在包涵體內(nèi),與主要外膜蛋白MOMP的分布模式相似,而與包涵體膜蛋白IncA的分布模式不同(圖4)。

圖2 His-CPSIT_0018重組蛋白表達的SDS-PAGE結(jié)果1:蛋白Marker;2:空菌(BL21)的表達產(chǎn)物;3:pET30a空載體轉(zhuǎn)化菌的表達產(chǎn)物;4:His-CPSIT_0018重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化菌的表達產(chǎn)物;5:未被誘導(dǎo)的重組菌可溶性產(chǎn)物(上清);6:未被誘導(dǎo)的重組菌非可溶性產(chǎn)物(沉淀);7:IPTG誘導(dǎo)的重組菌可溶性產(chǎn)物(上清);8.IPTG誘導(dǎo)的重組菌非可溶性產(chǎn)物(沉淀)

圖3 His-CPSIT_0018重組蛋白通過Ni-NTA進行純化的流程圖 1:蛋白Marker;2:首次流出液;3:洗滌液1;4:洗滌液2;5:洗滌液3;6:洗脫液1;7:洗脫液2;8:洗脫液3;9:洗脫液4;10:洗脫液5

3 討 論

Cps作為一種嚴格胞內(nèi)寄生菌,經(jīng)吞噬作用進入宿主細胞,并在宿主細胞內(nèi)形成包涵體,逃避機體免疫系統(tǒng)和調(diào)控宿主細胞基因的轉(zhuǎn)錄與翻譯。在此過程中Cps合成效應(yīng)蛋白(主要是毒力因子)并通過不同的分泌系統(tǒng)將它們注入宿主細胞內(nèi),從而影響宿主細胞正常新陳代謝及功能,導(dǎo)致宿主免疫反應(yīng)紊亂或細胞骨架重排,為衣原體的定植及其建立亞細胞的生態(tài)環(huán)境提供有利條件[5]。這提示:衣原體效應(yīng)蛋白可能在Cps的致病過程中發(fā)揮重要作用。

Ⅲ型分泌系統(tǒng)(Type III secretion system,T3SS)是革蘭陰性致病菌重要的分泌系統(tǒng),細菌通過T3SS將毒力蛋白注入宿主細胞內(nèi)發(fā)揮致病作用。有研究報道,Cps與革蘭陰性細菌一樣擁有T3SS。所以,篩選和鑒定Cps T3SS效應(yīng)蛋白并對其功能進行初步研究,能為開發(fā)具有新作用靶點的治療藥物奠定前期基礎(chǔ)。近年來有研究者對衣原體T3SS效應(yīng)蛋白的篩選和鑒定進行了相關(guān)的研究,并克隆表達了T3SS 3個結(jié)構(gòu)蛋白SctW、SctC和SctN和一個效應(yīng)蛋白IncA,免疫熒光檢測SctW和IncA定位于包涵體膜,SctC和SctN定位于菌體[6]。Cps T3SS效應(yīng)蛋白IncA與人GTP酶活化蛋白SH3域結(jié)合蛋白1(GTPase activating protein SH3 domain binding protein 1)結(jié)合,能抑制HEK293細胞內(nèi)c-Myc蛋白的表達[7]。Prantner等使用T3SS抑制劑(INP0007)可抑制沙眼衣原體的生長和細胞的炎癥反應(yīng),加入FeSO4雖然可恢復(fù)其生長,但是細胞炎癥反應(yīng)依然被抑制[8]。本課題組通過計算機軟件分析預(yù)測了多個Cps效應(yīng)蛋白,CPSIT_0018就是其中之一。

圖4 CPSIT_0018蛋白在Cps感染的Hela細胞中的定位(10×100)

本研究采用PCR方法從Cps 6BC基因組DNA模板擴增CPSIT_0018全長編碼基因,通過DNA重組技術(shù)構(gòu)建了pET30a-CPSIT_0018重組質(zhì)粒,核苷酸序列測定證實擴增的目的基因與GenBank登錄的基因序列完全一致,表明重組載體構(gòu)建成功。將其轉(zhuǎn)化到E.coli BL21中,經(jīng)不斷摸索和優(yōu)化條件,表達可溶性蛋白,并采用Ni-NTA層析法對重組蛋白進行純化。用高純度的重組蛋白免疫3～4周齡BALB/c小鼠,得到了鼠抗CPSIT_0018的特異性免疫血清,經(jīng)間接ELISA法檢測抗體效價?？贵w可用于IFA,以便觀察CPSIT_0018蛋白亞細胞定位,結(jié)果發(fā)現(xiàn):在感染的Hela細胞中CPSIT_0018蛋白與主要外膜蛋白MOMP的分布模式相似,而與包涵體膜蛋白IncA的分布模式不相同,這表明CPSIT_0018是定位在Cps 6BC菌體上的蛋白。推測CPSIT_0018的這種定位方式可能與衣原體裂解胞膜釋放出胞外或保護胞外EB免受各種不利因素作用等有關(guān)[9]。進一步尋找與CPSIT_0018相互作用的宿主細胞靶蛋白,探討其作用機制等將有望為衣原體致病機制研究提供新的研究方向。

[1]Jencek JE,Beaufrère H,Tully TN,et al.An outbreak of Chlamydophila psittaci in an outdoor colony of Magellanic penguins(Spheniscus magella-nicus)[J].J Avian Med Surg,2012,26(4):225-231.

[2]Dickx V,Vanrompay D.Zoonotic transmission of Chlamydia psittaci in a chicken and turkey hatchery[J].J Med Microbiol,2011,60(6):775-779.

[3]Dolcetti R,Ponzoni M,Ferreri AJ,et al,Genetic and epigenetic changes linked to Chlamydophila psittaci associated ocular adnexal lymphomas[J].Hematol Oncol,2010,28(1):1-2.

[4]Bode J,Dutow P,Sommer K,et al.A new role of the complement system:C3 provides protection in a mouse model of lung infection with intracellular Chlamydia psittaci[J].PLoS One,2012,7(11):e50327.

[5]Dean P.Functional domains and motifs of bacterial type III effector proteins and their roles in infection[J].FEMS Microbiol Rev,2011,35(6):1100-1125.

[6]Beeckman DS,Geens T,Timmermans JP,et al.Identification and characterization of a type III secretion system in Chlamydophila psittaci[J].Vet Res,2008,39(3):27.

[7]Borth N,Litsche K,Franke C,et al.Functional interaction between type III-secreted protein IncA of Chlamydophila psittaci and human G3BP1[J].PLoS One,2011,6(1):e16692.

[8]Prantner D,Nagarajan UM.Role for the chlamydial type III secretion apparatus in host cytokine expression[J].Infect Immun,2009,77(1):76-84.

[9]陸春雪,曾浩,吳移謀,等.沙眼衣原體蛋白水解酶CT841在感染細胞中的定位及抗原性研究[J].免疫學(xué)雜志,2012,28(3):203-207.