何 軍 ,游曉星 ,伍紹堅 ,田 巍 ,吳移謀

(1.南華大學(xué)附屬南華醫(yī)院檢驗科,湖南衡陽42100;2.南華大學(xué)病原生物學(xué)研究所)

支原體是一類缺乏細(xì)胞壁、呈高度多形性、能通過濾菌器、可在無細(xì)胞的培養(yǎng)中繁殖的最小原核細(xì)胞型微生物。生殖支原體(Mycoplasma genitalium,Mg)是從非淋菌性尿道炎患者尿道分泌物中分離出的一種支原體,可引起急慢性尿道炎、陰道炎、子宮內(nèi)膜炎、盆腔炎、輸卵管性不孕等多種疾病,并且作為AIDS相關(guān)支原體與HIV患者的死亡密切相關(guān)[1-3]。由于支原體缺乏細(xì)胞壁,其膜表面存在的大量脂質(zhì)相關(guān)膜蛋白(lipid-associated membrane proteins,LAMPs)是其黏附、定植、入侵宿主細(xì)胞以及引起宿主炎癥反應(yīng)的物質(zhì)基礎(chǔ)[4]。單核細(xì)胞是人類天然免疫的首要防線,也是分化為巨噬細(xì)胞、樹突狀細(xì)胞的共同前體細(xì)胞。本研究通過提取Mg LAMPs刺激THP-1細(xì)胞,初步探討LAMPs的活性成分及人血清對其誘導(dǎo)TNF-α水平變化的影響。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

Mg-37標(biāo)準(zhǔn)株由南華大學(xué)病原生物學(xué)研究所保存,人單核細(xì)胞系THP-1細(xì)胞購自武漢大學(xué)中國典型培養(yǎng)物保藏中心。青霉素、多粘菌素B、LPS購自Solarbio;無支原體牛血清和超級新生胎牛血清購自四季青生物工程公司;RPMI-1640培養(yǎng)基購自Hyclone;PPLO購自BD公司;脂蛋白脂肪酶和蛋白酶K購自Sigma-Aldrich;人腫瘤壞死因子α ELISA試劑盒購自eBioscience;1%人血清來自正常體檢者并經(jīng)其同意使用。

1.2 Mg培養(yǎng)及LAMPs的提取

將Mg菌液按1∶40比例接種于PPLO改良培養(yǎng)基中于95%CO2、37℃恒溫下培養(yǎng)3～4天,培養(yǎng)基顏色由玫瑰紅色變?yōu)榍辶恋某壬珪r,表示Mg生長已進入對數(shù)期。Mg LAMPs的提取按照參考文獻進行[5],BCA法測定蛋白濃度后置于-80℃?zhèn)溆?。Mg LAMPs在刺激前用100 μg/mL多粘菌素B處理2 h,去除可能存在的內(nèi)毒素污染。

1.3 THP-1細(xì)胞培養(yǎng)及LAMPs刺激

THP-1細(xì)胞在含10%胎牛血清的1640培養(yǎng)基中,于37℃、5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。接種前換無血清培養(yǎng)基,在24孔培養(yǎng)板中每孔接種1×105THP-1細(xì)胞,分別加入不同濃度的 LAMPs,LPS(100 ng/mL),PBS至孔中混勻孵育8 h。

1.4 TNF-α水平的測定及LAMPs的預(yù)處理

THP-1細(xì)胞被刺激后,經(jīng)兩次反復(fù)凍融后離心取上清,采用ELISA法根據(jù)具體操作說明書進行測定。LAMPs分別與100 μg/mL脂蛋白脂肪酶,蛋白酶K,人血清在37°C下混勻孵育2 h后再用于細(xì)胞刺激。

1.5 統(tǒng)計學(xué)分析

計量資料采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示,每組實驗重復(fù)三次,組間比較采用t檢驗,運用SPSS 13.0軟件進行分析,P＜0.05表示其差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 Mg LAMPs的提取及初步鑒定

Mg LAMPs提取后經(jīng)15%SDS-PAGE電泳,結(jié)果證實Mg LAMPs為一混合蛋白,大部分蛋白位于19～48 KDa之間(圖1)。

圖1 Mg LAMPs的SDS-PAGE蛋白質(zhì)電泳圖 1:Mg LAMPs;2:蛋白Maker

2.2 LAMPs誘導(dǎo)THP-1細(xì)胞分泌TNF-α

以0.1～4.0 μg/mL的 Mg LAMPs分別誘導(dǎo)THP-1細(xì)胞8 h,ELISA結(jié)果顯示,TNF-α水平明顯增加,并且隨 LAMPs的濃度增加而增加。4.0 μg/mL LAMPs刺激后 TNF-α 水平增高了7倍(圖2)。

圖2 Mg LAMPs誘導(dǎo)THP-1細(xì)胞分泌TNF-α 與前一組相比,*:P＜0.05

2.3 Mg LAMPs中脂質(zhì)成分誘導(dǎo)THP-1細(xì)胞分泌TNF-α

Mg LAMPs分別被100 μg/mL脂蛋白脂肪酶和蛋白酶K孵育2 h后刺激THP-1細(xì)胞,ELISA結(jié)果顯示,被脂蛋白脂肪酶(Lipoprotein lipase)處理的LAMPs誘導(dǎo)TNF-α水平明顯降低,而被蛋白酶 K(Proteinase K)處理的LAMPs誘導(dǎo)TNF-α水平變化不明顯(圖3)。

2.4 人血清上調(diào)LAMPs誘導(dǎo)的TNF-α水平

在與1%人血清(1%Serum)孵育2 h后,Mg LAMPs刺激THP-1細(xì)胞8 h,ELISA結(jié)果顯示TNF-α水平明顯上升,明顯高于同濃度未加人血清組(NOSerum),并且隨LAMPs濃度增加而增加(P＜0.05)(圖4)。

圖3 LAMPs中脂質(zhì)成分誘導(dǎo)THP-1細(xì)胞分泌TNF-α 與PBS組相比,*:P＜0.05.Unstimulated:未刺激組;LPS:脂多糖

圖4 人血清上調(diào)LAMPs誘導(dǎo)的TNF-α水平 與1%人血清前一組比較,*:P＜0.05

3 討 論

支原體細(xì)胞膜是與宿主細(xì)胞相互作用的主要成分,而膜上豐富的類似于LPS的LAMPs是影響機體炎癥反應(yīng)的主要蛋白。目前已證實LAMPs能誘導(dǎo)多種細(xì)胞分泌一系列炎癥因子和誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡、壞死[6]。由于生物活性的發(fā)揮可能要通過LAMPs中各種蛋白相互作用,因些對LAMPs的整體研究相對單個脂蛋白來說更有意義。我們前期研究發(fā)現(xiàn)Mg LAMPs能激活 NF-κB,并且與 TLR2 有關(guān)[7]。 NF-κB信號通路活化的重要作用是通過誘導(dǎo)激活下游的免疫及炎性相關(guān)因子的轉(zhuǎn)錄表達(dá)。本研究發(fā)現(xiàn)Mg LAMPs為混合蛋白,大部分蛋白位于19～48 KDa之間,具有明顯的生物活性,能激活THP-1細(xì)胞表達(dá)大量TNF-α,并且其水平與LAMPs濃度呈明顯的劑量依賴性。支原體感染多傾向于慢性或隱性感染,由于產(chǎn)生的TNF-α具有組織損傷和免疫保護雙重作用,最后走向取決于機體免疫系統(tǒng)之間的相互作用。

人血清中含有多種生物活性蛋白,其中包括介導(dǎo)LPS生物活性的脂多糖結(jié)合蛋白(lipopolysaccharide-binding protein,LBP),CD14等。LBP由肝細(xì)胞合成和分泌,在血清中的正常濃度為5～10 mg/L,急性反應(yīng)期可升高到200 mg/L,與LPS中的類脂體A具有高度親和性[8]。在血清中的CD14主要為可溶性CD14(soluble CD14,sCD14),主要由單核細(xì)胞產(chǎn)生,其正常濃度為2～5mg/ml,占血中全部CD14含量的99%[9]。TNF-α作為致機體產(chǎn)生炎癥反應(yīng)的重要因子。sCD14能直接與LPS結(jié)合,介導(dǎo)LPS所致的TNF-α的產(chǎn)生。LBP本身并不能誘導(dǎo)TNF-α的產(chǎn)生,但LBP卻能明顯增強LPS對TNF-α的誘生作用,增加TNF-α mRNA轉(zhuǎn)錄的速度和程度,使TNF-α水平明顯上升[10]。我們推測人血清可能對類似于LPS的LAMPs有一定的作用,結(jié)果發(fā)現(xiàn),人血清能明顯上調(diào)LAMPs誘導(dǎo)的TNF-α的產(chǎn)生。研究發(fā)現(xiàn),脂質(zhì)能夠與許多微生物中脂蛋白N-末端半胱氨酸的Src同源序列結(jié)合,而支原體的生物學(xué)活性也剛好位于N-末端脂肽部分[11]。通過脂蛋白脂肪酶和蛋白酶K預(yù)處理后發(fā)現(xiàn),LAMPs中誘導(dǎo)活性成分為脂質(zhì)部分,并非蛋白部分。研究證實LAMPs的生物活性不僅與其脂質(zhì)成分,脂肽的、脂肪酸鏈的飽和程度、數(shù)量及酰化程度有關(guān)[12-13],而且最近研究發(fā)現(xiàn),LBP能結(jié)合三?；投；?CD14能結(jié)合二酰化脂肽介導(dǎo)免疫反應(yīng)[14-15]。本文作者推測人血清的上調(diào)作用可能是上清中LBP和sCD14的共同作用。因此,通過誘導(dǎo)TNF-α表達(dá)而對機體組織產(chǎn)生保護或損傷作用,這可能是Mg感染所引起的炎癥反應(yīng)的基礎(chǔ),同時也為Mg的致病機制研究及防治提供新的思路。

[1]Plecko V,Zele SL,Tripkovic V,et al.Mycoplasma genitalium:clinical significance and diagnosis[J].Acta Dermatovenerol Croat,2013,21(4):236-240.

[2]McGowin CL,Rohde RE,Redwine G.Epidemiological and clinical rationale for screening and diagnosis of Mycoplasma genitalium infections[J].Clin Lab Sci,2014,27(1):47-52.

[3]Vandepitte J,Bukenya J,Hughes P,et al.Clinical characteristics associated with Mycoplasma genitalium infection among women at high risk of HIV and other STI in Uganda[J].Sex Transm Dis,2012,39(6):487-491.

[4]Bai F,Ni B,Liu M,et al.Mycoplasma hyopneumoniae-derived lipid-associated membrane proteins induce apoptosis in porcine alveolar macrophage via increasing nitric oxide production,oxidative stress,and caspase-3 activation[J].Vet Immunol Immunopathol,2013,155(3):155-161.

[5]Shimizu T,Kida Y,Kuwano K.Triacylated lipoproteins derived from Mycoplasma pneumoniae activate nuclear factor-κB through toll-like receptors 1 and 2[J].Immunol,2007,121(4):473-483.

[6]Adamu JY,Wawegama NK,Browning GF,et al.Membrane proteins of Mycoplasma bovis and their role in pathogenesis[J].Res Vet Sci,2013,95(2):321-325.

[7]何軍,游曉星,曾焱華,等.生殖支原體LAMPs經(jīng)TLR2激活NF-κB[J].中華微生物學(xué)和免疫學(xué)雜志,2010,30(12):1137-1140.

[8]Nam BH,Ahn KJ,Kim YO,et al.Molecular cloning and characterization of LPS-binding protein/bactericidal permeability-increasing protein (LBP/BPI) from olive flounder,Paralichthys olivaceus[J].Vet Immunol Immunopathol,2010,133(2-4):256-263.

[9]Romero-Sanchez M,Gonzalez-Serna A,Pacheco YM,et al.Different biological significance of sCD14 and LPS in HIV-infection:importance of the immunovirology stage and association with HIV-disease progression markers[J].J Infect,2012,65(5):431-438.

[10]Ranoa DR,Kelley SL,Tapping RI.Human lipopolysaccharide-binding protein(LBP)and CD14 independently deliver triacylated lipoproteins to Toll-like receptor 1(TLR1)and TLR2 and enhance formation of the ternary signaling complex[J].J Biol Chem,2013,288(14):9729-9741.

[11]Shibata K,Hasebe A,Into T,et al.The N-terminal lipopeptide of a 44-kDa membrane-bound lipoprotein of Mycoplasma salivarium is responsible for the expression of intercellular adhesion molecule-1 on the cell surface of normal human gingival fibroblasts[J].J Immunol,2000,165(11):6538-6544.

[12]Choi SY,Lim JW,Shimizu T,et al.Reactive oxygen species mediate Jak2/Stat3 activation and IL-8 expression in pulmonary epithelial cells stimulated with lipid-associated membrane proteins from Mycoplasma pneumoniae[J].Inflamm Res,2012,61(5):493-501.

[13]Liu YC,Lin IH,Chung WJ,et al.Proteomics characterization of cytoplasmic and lipid-associated membrane proteins of human pathogen Mycoplasma fermentans M64[J].PLoS One,2012,7(4):e35304.

[14]Schr?der NW,Heine H,Alexander C,et al.Lipopolysaccharide binding protein binds to triacylated and diacylated lipopeptides and mediates innate immune responses[J].J Immunol,2004,173(4):2683-2691.

[15]Nakata T,Yasuda M,Fujita M,et al.CD14 directly binds to triacylated lipopeptides and facilitates recognition of the lipopeptides by the receptor complex of Toll-like receptors 2 and 1 without binding to the complex[J].Cell Microbiol,2006,8(12):1899-1909.