朱軍寶 ,劉步平 ,張 泓 ,林亞平 ,張雨辰 ,陳楚淘

(1.廣西柳州市中醫(yī)院,廣西柳州545001;2.廣州中醫(yī)藥大學(xué)針推學(xué)院;3.湖南中醫(yī)藥大學(xué)針推學(xué)院;4.湖南省中醫(yī)院針灸科)

腦缺血再灌注損傷(cerebral ischemia reperfusion injury,CIRI)后神經(jīng)細(xì)胞的死亡形式有多種,主要表現(xiàn)為缺血核心區(qū)立即發(fā)生的細(xì)胞壞死,以及隨后再灌注過程中由氧化應(yīng)激和炎癥反應(yīng)等機(jī)制引起的細(xì)胞凋亡和自噬[1]。課題組前期實(shí)驗(yàn)證明針刺對(duì)CIRI療效明顯[2],且能明顯抑制細(xì)胞凋亡,大量文獻(xiàn)顯示,腦缺血再灌注后細(xì)胞死亡及其機(jī)制的神經(jīng)保護(hù)研究已成為關(guān)注的熱點(diǎn),但是大多是個(gè)別探討,而整體綜合探討凋亡相關(guān)的蛋白未見相關(guān)報(bào)道。而高通量的蛋白芯片技術(shù)可以一次性檢測(cè)不同種類蛋白磷酸化變化表達(dá),本實(shí)驗(yàn)采用蛋白芯片技術(shù)篩選與細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白的種類,探究針刺治療CIRI后凋亡相關(guān)的蛋白,為針刺治療CIRI疾病提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動(dòng)物 40只雄性成年SD大鼠,體重240±10 g(長沙斯萊克景達(dá)公司,許可證號(hào) scxk[湘]2009-0004)。

1.1.2 儀器 DKZ-2型電熱恒溫震蕩水槽(上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備公司),TGL16M臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)(長沙科威實(shí)業(yè)公司),ML-902定時(shí)恒溫磁力攪拌器(上海浦江分析儀器廠),MDF-435超低溫冰箱(日本三洋電機(jī)公司)等。

1.1.3 試劑 720抗體蛋白芯片(美國springbio公司),細(xì)胞和組織總蛋白抽提試劑盒及BCA蛋白定量試劑盒(上?？党缮锕こ坦?,鏈霉蛋白酶、封閉液以及DTT(德國Merk公司),BSA和Percoll(美國Pharmacia公司),HEPES(美國Biosource公司)等。

1.2 方法

1.2.1 動(dòng)物分組 40只大鼠實(shí)驗(yàn)前常規(guī)飼養(yǎng)1周以適應(yīng)環(huán)境,先隨機(jī)挑選10只為假手術(shù)組,其余30只先造模,成功后再隨機(jī)分至其余三組(模型組,針刺對(duì)照點(diǎn)組,針刺穴位組),10只/組。

1.2.2 模型制作 稱重,麻醉(按照30 mg/100 g標(biāo)準(zhǔn)腹腔注射10%水合氯醛)仰臥位固定于鼠板,距左側(cè)正中0.3 cm處縱行切口,約1 cm,鈍性剝離皮下筋膜、肌肉與甲狀腺,充分暴露頸總動(dòng)脈(common carotid artery,CCA)及分支頸內(nèi)動(dòng)脈(internal carotid artery,ICA)、頸外動(dòng)脈(external carotid artery,ECA),剝離CCA及迷走神經(jīng),暴露血管、神經(jīng),再在CCA、ICA、ECA處掛線,在CCA近心端、ECA及ICA處掛線備用,微動(dòng)脈夾暫時(shí)夾閉ICA,然后近心端結(jié)扎CCA、ECA。然后在距CCA分叉部3 mm處剪一小口,將拴線插入到ICA,松開動(dòng)脈夾,在插入深度19 mm處系牢ICA遠(yuǎn)心端的細(xì)線,縫合傷口,單籠飼養(yǎng)。假手術(shù)組僅分離左側(cè)CCA并結(jié)扎CCA及ECA,不栓塞ICA。術(shù)后待大鼠生命體征穩(wěn)定,按Longa等[3]法進(jìn)行神經(jīng)功能評(píng)分,1～3分視為造模成功。

1.2.3 穴位定取 參照《實(shí)驗(yàn)針灸學(xué)》及《實(shí)驗(yàn)動(dòng)物圖譜》:大椎:第7頸椎與第1胸椎間,背部正中;百會(huì):頂骨正中;人中:唇裂鼻尖下1 mm正中處;對(duì)照點(diǎn)均取穴左側(cè)旁開0.3 cm的非經(jīng)非穴點(diǎn)。

1.2.4 治療方法 待大鼠生命體征平穩(wěn)后,假手術(shù)組與模型組大鼠只捆綁不針刺。針刺穴位組大椎穴直刺5 mm,百會(huì)穴平刺10 mm,人中穴向鼻中隔斜刺2 mm。針后捻轉(zhuǎn)1 min/穴,期間再捻轉(zhuǎn)1次,留針30 min,12 h/次針刺,連續(xù)6次。針刺對(duì)照點(diǎn)治療方法同針刺穴位組。

1.2.5 檢測(cè)方法 連續(xù)6次治療后用10%水合氯醛腹腔麻醉后迅速斷頭,取左側(cè)缺血腦組織,置于液氮中保存,待行抗體蛋白芯片檢測(cè)。參照說明書進(jìn)行:按每250 mg組織中加入1 mL預(yù)先配好的蛋白質(zhì)抽提試劑(1 mL抽提試劑中加入5 μL蛋白酶抑制劑混合液,5 μL苯甲基磺酰氟和5 μL磷酸酶混合液)抽提蛋白;勻漿至組織完全裂解(30 s/次,每次勻漿間隔冰浴1 min);再離心(14 000 g×15 min),保存上清;BCA法蛋白質(zhì)定量,并制備成蛋白含量為6 μg/μL的電泳樣品;生物素標(biāo)記蛋白樣品(蛋白樣品和生物素標(biāo)記物的比值保持為7∶1)并純化生物素標(biāo)記的蛋白;將生物素標(biāo)記的蛋白樣品與芯片雜交,行芯片檢測(cè),再圖像掃描(Genepix 4000B),532 nm激發(fā),熒光掃描儀掃描芯片,獲取數(shù)據(jù)與圖片,圖像儲(chǔ)存(TIF格式),分析數(shù)據(jù)(Genepix Pro 6.0)。

1.3 蛋白芯片數(shù)據(jù)分析過程

根據(jù)相關(guān)數(shù)據(jù),篩選各組磷酸化水平上調(diào)≥1.5和下調(diào)≤0.67倍且與凋亡相關(guān)蛋白。

2 結(jié) 果

2.1 各組抗體蛋白芯片的表達(dá)譜

6次處理后各組蛋白芯片表達(dá)譜結(jié)果見圖1,圖片上綠色熒光亮度越強(qiáng)表示該種蛋白磷酸化的程度愈高,4個(gè)圖片兩兩重疊觀察,發(fā)現(xiàn)芯片圖同一位置熒光點(diǎn)的強(qiáng)弱不一致,提示該蛋白經(jīng)過6次處理蛋白磷酸化水平出現(xiàn)了不同程度的上調(diào)或下調(diào)變化。

2.2 各組上調(diào)≥1.5倍、下調(diào)≤0.67倍凋亡相關(guān)蛋白

與假手術(shù)組比較,模型組8種蛋白磷酸化上調(diào)程度≥1.5倍,其中以BAG-1上調(diào)最為顯著;出現(xiàn)下調(diào)程度≤0.67倍的蛋白有4種,其中Cytochrome c下調(diào)最為顯著(表1),提示腦缺血再灌注損傷后神經(jīng)元細(xì)胞出現(xiàn)凋亡,造模成功。與模型組比較,對(duì)照點(diǎn)組有5種、穴位組2種凋亡相關(guān)蛋白出現(xiàn)顯著上調(diào);而對(duì)照點(diǎn)組有8種、穴位組11種凋亡相關(guān)蛋白顯著下調(diào),其中3種顯著下調(diào)蛋白(Cytochrome c、DFF45/ICAD、PARP)在對(duì)照點(diǎn)組與穴位組中同時(shí)存在。模型組下調(diào)的蛋白種類在對(duì)照點(diǎn)組與穴位組中未出現(xiàn)上調(diào);模型組上調(diào)的蛋白種類在穴位組有3種出現(xiàn)下調(diào)(TRADD、FLIP、AIF),而在對(duì)照點(diǎn)未出現(xiàn)上調(diào),針刺能有效抑制細(xì)胞凋亡的發(fā)生(表2)。

圖1 各組抗體蛋白芯片表達(dá)譜 A:假手術(shù)組;B:模型組;C:對(duì)照點(diǎn)組;D:穴位組

表1 模型組/假手術(shù)組在不同芯片序列時(shí)的凋亡相關(guān)蛋白上調(diào)或下調(diào)倍數(shù)

表2 模型組/對(duì)照點(diǎn)組、模型組/針刺穴位組在不同芯片序列時(shí)的凋亡相關(guān)蛋白上調(diào)或下調(diào)倍數(shù)

3 討 論

腦缺血時(shí)除神經(jīng)元細(xì)胞發(fā)生壞死外,還同時(shí)存在另外一種死亡形式——細(xì)胞凋亡[4]。細(xì)胞凋亡又稱為程序化細(xì)胞死亡,是一種生理?xiàng)l件下的細(xì)胞死亡,是有核細(xì)胞在一定條件下通過啟動(dòng)其自身內(nèi)部機(jī)制,主要通過內(nèi)源性DNA內(nèi)切酶的激活而發(fā)生的細(xì)胞自然死亡過程,有典型的形態(tài)特征,與壞死截然不同,通常情況下,細(xì)胞凋亡的發(fā)生可以被mRNA和蛋白合成抑制劑所阻抑,提示細(xì)胞凋亡受基因調(diào)控,本實(shí)驗(yàn)顯著上調(diào)蛋白中hsp70、Bax、NF-kB等均是腦缺血與凋亡研究的熱點(diǎn)之一[5-7]。細(xì)胞色素C(Cytochrome c)是線粒體釋放的一種促凋亡蛋白,在激活caspase誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡方面起重要作用,Cytochrome c的釋放是線粒體參與細(xì)胞凋亡的主要途徑[8],另有研究表明,部分抑制腦缺血再灌注引起的Cytochrome c表達(dá)增加可能是某些藥物的腦保護(hù)機(jī)制之一[9]。蛋白質(zhì)磷酸化與去磷酸化過程對(duì)許多生物的細(xì)胞功能起調(diào)控作用,調(diào)節(jié)著細(xì)胞分化和細(xì)胞生長等所有的生命活動(dòng)過程。研究顯示:改變生物的生長環(huán)境,可誘導(dǎo)體內(nèi)的蛋白質(zhì)磷酸化,導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)組成與數(shù)量發(fā)生改變,當(dāng)細(xì)胞中蛋白激酶或磷酸酶的活性受到抑制或過度表達(dá)時(shí),就會(huì)導(dǎo)致蛋白質(zhì)磷酸化過程紊亂,從而改變生物體的生理狀[10]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示:腦缺血損傷后,Cytochrome c、DFF45/ICAD、PARP諸多參與細(xì)胞凋亡的蛋白磷酸化水平發(fā)生了顯著變化,但具體水平以及具體的作用機(jī)制有待進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)證實(shí)。

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